Определение метаболитов и ферментов азотистого обмена в крови

Цель: научить определять мочевину и аминотрансферазы в сыворотке крови и интерпретировать полученные результаты.

Задачи обучения:

1.знать принципы методов определения мочевины и аминотрансферазы в сыворотке крови;

2.уметь составлять алгоритм проведения анализа;

3.уметь определять мочевину и аминотрансферазу в сыворотке крови;

4.знать диагностическую ценность данного анализа;

5.уметь интерпретировать полученные результаты.

Основные вопросы темы:

1.Роль мочевины в азотистом обмене.

2.Норма уровня мочевины в сыворотке крови.

3.Причины понижения уровня мочевины в сыворотке крови.

4.Роль аминотрансфераз в азотистом обмене.

5.Принцип метода определения мочевины в сыворотке крови.

6.Принцип метода определения аминотрансфераз в сыворотке крови.

7.Диагностическое значение определения мочевины в сыворотке крови.

8.Диагностическое значение определения аминотрансфераз в сыворотке крови.

Методы обучения – лабораторная работа.

Принцип метода определения мочевины в сыворотке крови – мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии  тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации мочевины в сыворотке крови и измеряется фотометрически.

Для анализа используется негемолизированная сыворотка крови или плазма (гепарин, ЭДТА).

Проведение анализа:

Отверстие пробирок закрывают алюминиевой фольгой и пробирки помещают точно на 10 мин в кипящую водяную баню. Потом содержимое пробирок быстро охлаждают под проточной водой и измеряют оптическую плотность пробы (А₁) и стандарта (А₂) против контрольного раствора. Измерение проводить до 15 мин после охлаждения.

Расчет:           Мочевина (моль/л) = 16,65х А₁/А₂

Нормальные величины мочевины в сыворотке крови:

Мочевина в сыворотке крови (моль/л)                                    2,5 – 8,3

Мочевина в моче за сутки (моль/24 ч)                                     333 – 583

Диагностическое значение определения мочевины в сыворотке крови.

Мочевина, конечный продукт обмена аминокислот, образуется в печени. Увеличение в несколько раз относительно верхнего предела нормы концентрации мочевины, сопровождающееся, как правило, выраженным клиническим синдромом интоксикации, называют уремией. Уремия, как и гиперазотемия, бывает абсолютной и относительной, продукционной и ретенционной. Определение мочевины имеет наибольшее значение для диагностики заболеваний почек.

При почечной патологии содержание мочевины нарастает гораздо быстрее, чем всех остальных компонентов остаточного азота, так как мочевина в наибольшей степени задерживается крови при ухудшении функции почек. Если в норме уровень азота мочевины составляет около 50%

остаточного азота сыворотки, то при почечной недостаточности он может увеличиваться до 90%.

Внепочечная ретенционная уремия наблюдается при нефролитиазе, рефлекторной анурии, опухолях предстательной железы, опухолях и камнях в мочевыводящих путях, сердечной декомпенсации.

Продукционная уремия выявляется при патологиях, сопровождающихся усиленным распадом белка: перитоните, аппендиците (особенно флегмонозном и гангренозном), закупорке кишок, ожогах, холере, лейкемии, инфаркте миокарда, тяжелых инфекционных заболеваниях, болезни Аддисона и т.д.

При обезвоживании организма (дизентерия) наблюдается относительная уремия.

К повышению уровня мочевины в сыворотке крови приводит прием анаболических стероидов, бутадиона, допегита, альдомета, препаратов железа, алкалоидов раувольфии, а также нефротоксичные лекарственные препараты.

Повышенное содержание мочевины в моче отмечается у больных со злокачественной анемией, лихорадкой, при диете с высоким содержанием белка, после приема салицилатов, хинина, при отравлении фосфором

Понижение уровня мочевины в моче выявляется у больных с уремией, нефритом, ацидозом, паренхиматозной желтухой, острой дистрофией печени, прогрессирующим циррозом.

Принцип метода определения аминотранферазы в сыворотке крови –аспартатаминотрансфераза катализирует реакцию между аспартатом и α-кетоглутаратом, в результате которой образуются глутамат и оксалоацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов α-кетоглутарата и пирувата в щелочной среде. Гидразон пирувата, возникающий при самопроизвольном декарбоксилировании оксалоацетата, обладает более высокой оптической плотностью.

Для анализа используется негемолизированная сыворотка крови или плазма (гепарин, ЭДТА).

Проведение анализа:

Инкубируют 3 мин при 37^оС

Инкубируют точно 60 мин при 37^оС

Перемешивают и оставляют стоять 20 мин при комнатной температуре.

Перемешивают и спустя 10 мин измеряют оптическую плотность пробы против контроля

Расчет: по оптической плотности пробы в калибровочном графике находят концентрацию фермента.

Нормальные величины аминотрасферазы в сыворотке крови (мккат/л):

АсАТ                                          0,06-0,14

Предельные величины            0,42

Диагностическое значение определения аминотрансфераз в сыворотке крови.

Активность аминотрансфераз исследуют для дифференциальной диагностики патологии печени и миокарда.

При инфаркте миокарда активность АсАТ в 95% случаев повышена, возрастание ее уровня происходит через 4-6 ч с момента приступа, через 24-36 ч увеличивается в 4-5 раз по сравнению с верхней границей нормы и лишь на 3-и – 7-е сутки снижается до нормы.

При патологии печени повышается АлАТ. Максимальное повышение АсАт и АлАТ происходит при остром вирусном гепатите – более чем 100 раз, снижение происходит медленно в течение нескольких недель и даже месяцев.

Результаты занести в тетради, сравнить с нормальными показателями, сделать выводы.

Анализ желудочного сока.

Желудочный сок – бесцветная жидкость с сильнокислой реакцией (рН 1,5 – 2). За сутки выделяется около 1,5 л. Состав: вода, белки, пепсин, гастриксин, муцин, соляная кислота, кислореагирующие фосфаты.

Совокупность всех кислореагирующих веществ – общая кислотность.

Соляная кислота, связанная с белками и продуктами их переваривания – связанная соляная кислота.

Свободная соляная кислота – оставшаяся в избытке.

Кислотность желудочного сока выражают в титрационных единицах (ТЕ), равных количеству мл 0,1 М раствора NаОН пошедших на титрование 100 мл желудочного сока в присутствии индикаторов: диметиламиноазобензола и фенолфталеина.

При патологиях в желудочном соке могут присутствовать молочная, масляная, пропионовая кислоты и кровь.

А) Реакция на свободную соляную кислоту:

1. в пробирку внести 5 капель соляной кислоты;
2. в другую – 5 капель желудочного сока;
3. в обе пробирки добавить по капле р-ра диметиламиноазобензола.

В пробирках появляется вишнево-красная окраска.

Б) Реакция на кровь с бензидином:

1. в пробирку внести 10 капель желудочного сока;
2. добавить 5 мл р-ра бензидина и 5 капель р-ра Н2О2.

При наличии крови развивается синее окрашивание.

В) Реакция на молочную кислоту (реакция Уффельмана):

1. в две пробирки налить по 10 капель р-ра фенола и добавить по каплям р-р хлорида железа до появления фиолетового цвета.
2. в одну пробирку добавить молочную кислоту, а во вторую – желудочный сок.
3. в присутствии молочной кислоты образуется желто-зеленое окрашивание.

Г) Определение кислотности желудочного сока:

1. в колбу внести 5 мл желудочного сока, добавить по две капли индикаторов: диметиламиноазобензола и фенолфталеина;
2. оттитровать 0,1 М раствором NаОН до желто-розовой окраски;
3. продолжить титрование до малинового цвета;
4. полученные цифры умножить на 20, полученные цифры показывают соответственно свободную соляную кислоту и общую кислотность желудочного сока. В норме:

Свободная соляная кислота – 20-40 ТЕ;

Связанная соляная кислота – 15-30 ТЕ;

Общая кислотность – 40-60 ТЕ.

Определение кислотности желудочного сока используют для диагностики различных заболеваний желудка.

Повышенная кислотность (гиперацидоз) обычно сопровождается изжогой, диареей и может быть симптомом язвы желудка и 12-перстной кишки, а также гиперацидного гастрита.

Пониженная кислотность (гипоацидоз) отмечена при некоторых видах гастритов.

Полное отсутствие соляной кислоты и пепсина (желудочная ахилия) наблюдается при атрофических гастритах и часто сопровождается пернициозной анемией вследствие недостаточности выработки фактора Касла и нарушения всасывания витамина В12

Анацидный желудочный сок (рН≥6) свидетельствует о значительной потере слизистой оболочкой желудка обкладочных клеток, секретирующих соляную кислоту, что часто вызывает рак желудка.

Литература:

1.Тапбергенов С.О. Медицинская биохимия.- Астана, 2001,с.214.

2.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М.,2005,с.438.

3.Биохимия, под ред. Чл.-корр. РАН, проф. Е.С. Северина.- М.,2005,с.16, 682.

4.Николаев А.Я. Биологическая химия.- М.,2004, с.59, 504.

5.Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике.-Минск, 2000, т.1,с. 286, 389.

Контрольные вопросы:

Принцип метода определения мочевины и аминотрансфераз в сыворотке крови?

В каких случаях  происходит понижение уровня мочевины в сыворотке крови?

Где образуется мочевина?

Какую реакцию катализирует АсАТ?

В чем причины повышения аминотрансфераз в сыворотке крови?

Диагностическое значение определения мочевины и аминотрансфераз в крови?

У больного плохой аппетит, тошнота, большая потеря веса, исхудание. При анализе желудочного сока определено: общая кислотность = 20 ед., свободной соляной кислоты нет, проба на кровь и молочную кислоту положительная, резко повышена активность ЛДГ. Дайте заключение по анализу.

При титровании желудочного сока установлено, что общая кислотность = 50 ед., Имеется ли отклонение от нормы?

У пациента боли в области желудка, малокровие. При анализе желудочного сока установлено: общая кислотность = 120 ед., свободная соляная кислота = 90 ед., связанная соляная кислота = 30 ед. Бензидиновая проба на кровь положительная. Количество мукопротеидов снижено. Дайте заключение по анализу.

Молочная кислота образуется в желудочном соке при:

а) гипоацидном гастрите;        б) гиперацидном гастрите;               в) ахилии;

г) верно а и в;                             д) верно а и б

Соляная кислота желудочного сока:

а) денатурирует белки пищи;                      б) создает оптимум рН для пепсина;

в) оказывает бактерицидное действие;       г) верно а, б и в;            д) верно а и б.

При ахилии, возникающей при атрофических гастритах в желудочном соке наблюдается:

а) гиперацидоз;              б) гипоацидоз;                в) отсутствие гастромукоидов;

г) полное отсутствие желудочного сока и НСl;              д) отсутствие лактата

Нормальные показатели связанной НСl желудочного сока:

а) 60-70 ТЕ;    б) 40-60 ТЕ;    в) 20-30 ТЕ;    г) 30-50 ТЕ;     д) 20-40 ТЕ.

Показатели желудочного сока при гиперацидном гастрите:

а) общая кислотность 80-90 ТЕ;                           б) свободная НСl 40-60 ТЕ;

в) свободная НСl  20-40 ТЕ;             г) верно а и в;                 д) верно а и б

Стимулирует секрецию желудочного сока:

а) серотонин;   б) адреналин;   в) ГАМК;    г) этаноламин;    д) гистамин

Показатели желудочного сока при гипоацидозе:

а) общая кислотность 20-40 ТЕ;                 б) свободная НСl 40-60 ТЕ;

в) свободная НСl  10-20 ТЕ;             г) верно а и в;                 д) верно а и б