Микроорганизімдерді бояу және анықтау тәсілдері

Бактериялардың жіктелуі

Микроазалар морфологиясы және жіктелуінің негіздері. Бактериалды жасушаның құрылысы. Жұғындыны дайындау техникасы.микроскопиялау техникасы. Бактерияларды тірі күйінде зерттеу әдісі.

Бактериялардың жіктелуі: Халықаралық кодекстің шешімі бойынша бактерияларға келесі таксономиялық категориялар ұсынылған:

Класы
Бөлімі
Реті
туыстастығы

Бактериялар прокариоттарға жатады, дәлірек айтқанда ядроға дей інгі организмге, өйткені оларда қабықшасыз, ядросыз, гистонсыз арнайы ядросы болады, ал цитоплпзмасында күрделі құрылымдар органеллалар ( митохондриялар, Гольджи аппараты, лизосомалар және т.б.) болмайды.

Берджидің ескі нұсқауларында бактериология жүйелігі бойынща бактерияларды жасуша қабырғасының ерекшелігіне қарай 4 бөлімге бөледі:

Firmicutes – жасуша қабырғасы қалың, грам оң бактериялар;
Gracilicutes – жасуша қабырғасы жұқа, грам теріс бактериялар;
Tenericutes – жасуша қабырғасы жоқ бактериялар;
Mendosicutes – жасуша қабырғасында ақауы бар археобактериялар;

Жасуша қабырғасы жұқа, грамтеріс эубактерияларды пішіні бойынша ажыратады:

Сфера пішінді, немесе коктар
Ирекше пішінді – спирохеталар мен спираллалар
Таяқша пішінді, риккетсиялар да жатады.

Жасуша қабырғасы қалың, грамоң бактерияларға жатады:

Сфера пішінді, немесе кокктар
Таяқша пішінді, сонымен қатар актимецеттер, микобактериялар мен бифидобактериялар.

Микробиологиялық зерттеулерге зерттеу материалын алу әдістері

Науқас адамдардан немесе тасымалдаушылардан зерттеу материалын алу кезінде белгілі ережелерді сақтау керек:

Аурулардың көп түрінде микробтар адам организмінде қан арқылы таралуына сәйкес көбінесе қан зерттеледі. Қосымша зәр, нәжіс, қақырық, асқазан жуындысы, бронхылар жуындысы, жұлын сұйықтығы, шырышты қабықшалардан алынған жұғынды алынады. Заттарды алу және зерттеу тағайындалған тәртіпке сәйкес болу керек. Мүмкіншілік болса заттарды тікелей аурудың өзінен алу керек.
Зерттеу материалын антибиотиктарды немесе басқа химиотерапевтикалық препараттарды қолданғанға дейін алу керек.

Материалды жеткілікті көлемде алу керек және оған қоршаған орта микроорганизмдерін жұқтырмас үшін асептика ережелерін сақтап алу керек. Стерильді материальды (қан) алуды оны микроорганизмдермен- адам организмінің қалыпты микрофлорасының өкілдерімен ластап алмай жүргізеді.

Зерттелетін материал мүмкін болса қысқа мерзімде бактериологиялық, вирусологиялық, микологиялық немесе серологиялық лабораторияға жеткізу керек. Оны жеткізу лабораторлық ыдыста немесе материалдың алғашқы температурасын сақтайтын немесе салқындататын, құрғақ мұзбен қатыратын арнайы контейнерде жеткізілуі керек. Лабораторияға бағытталған кез келген материал сәйкес бағыттамамен жеткізілу керек, онда науқастың аты-жөні, материал түрі және оны алған күні, аурудың алғашқы клиникалық диагнозы көрсетілуі керек.

Зерттелетін материалдан жағынды дайындау

Жағынды дайындау сатылары:

Шыныны дайындау. Шыныны майсыздандыру – кір сабын жағып, салфеткамен тазалау. Шыны көпіршеге қою.
Бактериологиялық ілмекті спирт жалынында толық қыздырғанша ұстай отырып, залалсыздандыру.
Егер жағынды тығыз ортадағы микробтардан дайындалса, алдын ала шынының бетіне бір тамшы физиологиялық ертінді тамызу керек.
Бактериолгиялық ілгекті от жалыныңда қыздырамыз. Зерттелетін заты бар пробирканы сол қолымызбен ұстаймыз, ұстаған кезде қоректік ортаның беті толық көрінуі керек, тығынды екінші саусақпен қысу арқылы ашамыз, пробирканың шетін міндетті түрде қыздыру керек. Бактериологиялық ілгекті сауыттың ішкі жағына суытып, зерттелетін затты аламыз және пробирка тығынын жабамыз.
Микробты ертіндіге ерітеміз және біркелкі етіп шыны бетіне жұқа, диаметрі 1-1,5 см болатындай жағынды дайындаймыз. Препарат дайындалғаннан соң ілмекті спирт жалынында залалсыздандырып, орнына қоямыз.
Жағындыны ауада кептіреміз және спиртовка жалынында бірнеше рез өткізу арқылы фиксациялаймыз. Шынының төменгі жағынан карандашпен белгілейміз.
Жағындының бетіне 1-2 тамшы бояу тамызамыз. 2-3 мин ұстап, жағындыны жуып, сорғыш қағазбен кептіріп, иммерсиялық жүйемен микроскоптаймыз.

Бактериялардың таза дақылынан жағынды дайындау

Жағынды дайындау сатылары:

Шыныны дайындау. Шыныны майсыздандыру – кір сабын жағып, салфеткамен тазалау. Шыны көпіршеге қою.
Бактериологиялық ілмекті спирт жалынында толық қыздырғанша ұстай отырып, залалсыздандыру.
Егер жағынды тығыз ортадағы микробтардан дайындалса, алдын ала шынының бетіне бір тамшы физиологиялық ертінді тамызу керек.
Бактериолгиялық ілгекті от жалыныңда қыздырамыз. Зерттелетін заты бар пробирканы сол қолымызбен ұстаймыз, ұстаған кезде қоректік ортаның беті толық көрінуі керек, тығынды екінші саусақпен қысу арқылы ашамыз, пробирканың шетін міндетті түрде қыздыру керек. Бактериологиялық ілгекті сауыттың ішкі жағына суытып, зерттелетін затты аламыз және пробирка тығынын жабамыз.
Микробты ертіндіге ерітеміз және біркелкі етіп шыны бетіне жұқа, диаметрі 1-1,5 см болатындай жағынды дайындаймыз. Препарат дайындалғаннан соң ілмекті спирт жалынында залалсыздандырып, орнына қоямыз.
Жағындыны ауада кептіреміз және спиртовка жалынында бірнеше рез өткізу арқылы фиксациялаймыз. Шынының төменгі жағынан карандашпен белгілейміз.
Жағындының бетіне 1-2 тамшы бояу тамызамыз. 2-3 мин ұстап, жағындыны жуып, сорғыш қағазбен кептіріп, иммерсиялық жүйемен микроскоптаймыз.

Микроскоптың иммерсиялық жүйесінің көмегімен жағындыны микроскопиялау.

Иммерсиялық объективпен препаратты микроскопиялағанда мына ережелерді сақтау керек:

Дайындалған және боялған жағындыға аздап иммерсялық май тамшысын тамызып, препаратты заттық үстелге қою, жарық сәулесінің түсуін реттеу.
Револьверді бұрау және иммерсиялық объективті 90-ға қою, тубусты объективтің фронтальді линзасының майға батуына дейін төмен түсіру.
Макровинттің көмегімен бағдарлаушы фокусты қою, микровинтпен препаратты соңғы фокусқа келтіріп қою.
Жұмыс аяқталған соң микроскопты белгілі бір тәртіпке келтіру. Объективтелген майды құрғақ шүберекпен сүрту, револьвелді кіші, құрғақ 8 объективіне қояды

Жағындыда бактерияларды морфологиясы бойынша ажырату.

Бактериялардың морфологиясын зерттеу үшін олардан нативті (тірі) және бекітілген жағындылар жасап, анилинді бояулармен бояйды. Бояудың негізінде күрделі химиялық және физико-химиялық реакциялар жатыр. Оларды бояу үшін негізгі бояуларды қолданады: метилен көгі, кристалды фиолет түсі т.б. Бактерия жасушасындағы әртүрлі құрылымдық элементтерді анықтау үшін нейтралды және қышқыл бояулар қолданылады. Бактерияларды қарапайым әдіспен бояғанда, оларды морфологиясы бойынша ажыратуға болады. Қарапайым бояу әдісінде бактериялардың диплококк, стафилококк немесе иректелген, таяқша т.б бактерияларға жататынын анықтаймыз. Сонымен қатар талшықтарды, жасуша қабырғасын, нуклеоидты және әртүрлі цитоплазмалық қосындыларды анықтауда қолданылатын арнайы бояу әдістері бар. Мысалы, Гинс-Бурри әдісімен капсуланы анықтау, Нейссер әдісімен валютин дәндерін анықтау, Циль-Нельсен және Ожешка әдісімен спораны анықтау, Лефлер әдісімен талшықтарды анықтау т.б.

Жағындыда бактерияларды тинкториялды қасиеті бойынша ажырату:

Тинкториальды қасиеті – бояуларды сіңіру және ұстап тұру қабілеті, ол бактерия клеткасының құрылым ерекшеліктеріне және химиялық құрамына байланысты. Күрделі бояу әдістері осы көрсеткіштер бойынша бактерияларды салыстыруға мүмкіндік береді және диагностикалық маңызы бар.

Жағындыны Грамм бойынша бояу

Грамм бойынша бояу дегеніміз — бактериялардың бар не жоғын, оларды граммы оң немесе теріс екенін анықтау үлін қолданылатын негізгі әдістердің бірі. Бактерия қабырғасының биохимиялық қасиетіне негізделген.

Бекітілген жағындыға сүзгі қағаз арқылы генциан фиолеттің карбол – спирттік ертіндісін тамызамыз. 1-2 мин кейін оны алып тастап, бояуды төгеміз.
1-2 мин-қа Люголь ерітіндісін тамызамыз;
Этиль спиртімен 30-60 с бояудың күлгін түсі кеткенге дейін түссіздендіреміз.
Сумен шаямыз
1-2 мин фуксиннің сулы ертіндісімен бояп,сумен шаямыз, кептіріп, микроскоптаймыз.

Грам оң бактериялар қою-күлгін түске, грам теріс бактериялар – қызыл түске боялады. Бұл әдістің негізінде таңдамалы түссіздендіру жатыр – генциан фиолеттің йодпен кешенін спирт әсерінен жою. Грам әдісі бойынша бояу нәтижесінде бактерияның клетка қабырғасының химиялық құрамы мен құрылыс ерекшеліктері анықталады және бояу процесі нәтижесінде түзілген генциан фиолеттің йодпен кешенін ұстап қалу қабілетіне байланысты.

Фирмикутты бактериялар грам оң боялады, себебі тейхой қышқылымен байланысты көп қабатты пептидогликаны бар. Ол бояудың тығыз бекуіне және спиртпен түссіздендіруге резистентті болады.

Грам он бактерияларда – жасуша қабырғасы жуан, пептидогликаны 90%, липополисахаридтер 10%, тейхой қышқылы бар.

Грациликутты бактериялар грам теріс боялады. Грам теріс бактерияларда пептидогликаны жінішке 10%, липополисахаридтер 90%, тейхой кышқылы жоқ.

Жағындыны қарапайым әдіспен бояу. Қарапайым әдіспен бояуда бекітілген жағындыны қандайда бір бояумен бояу: фуксинмен, метилен көгімен немесе генциан фиолетпен бояу. 2 мин өткенен соң сумен жуу, сорғыш қағазбен сордыру және микроскопиялау.

Ілінген тамшы мен жаңшылған тамшы препараттарын дайындау

Ілінген тамшы. Микробтардың қозғалысын, дамуын, көбеюін, споралардың пайда болуы мен өсіп өнуін бақылау үшін қолданылады.Препарат дайындау үшін арнаулы ортасында ойығы бар заттық шыны қолданылады. Зерттелетін заттың аздаған тамшысын жабын әйнектің ортасына тамызады. Заттық шыныдағы ойықтың шетіне вазилин майын жағу керек. Заттық шыныны жабын әйнектің үстіне тамшы ойықтың ортасына келетіндей қылып орналастыру керек. Осыдан кейін жабын әйнекті үстіне қаратып, тез арада заттық шыныны аударады. Дұрыс дайындалған препаратта тамшы жан-жағына, түбіне тимей, ойықта бос ілініп тұру керек. Препаратта аздап қараңғыланған көру аймағымен микроскоптайды; алғашында аздап үлкейтетін объективті (8 немесе 10) пайдаланады, тамшының шетін тауып, содан кейін объективті 40 қояды немесе иммерсионды объективті пайдаланады. Бактериялардың қозғалғыштығын анықтайды.

Жаншылған тамшы әдісімен жағынды дайындау. Таза заттық әйнек бетіне құбыр суының тамшысын тамызады, оған ілмекпен бір тамшы (жабын әйнектің шетінен шықпайтындай тамшы аз болу керек) зерттелетін затты немесе бактерия суспензиясын тамызамыз, сосын тамшыны жабын әйнекпен жабады. Бір шетінде метилен көгін тамызады. Бұнда бактериялар көк немесе қызыл түске боялады. Әйнек шетінен шыққан суды сорғыш қағазбен сорғытамыз.Ескерту: жабын әйнек ортасында ауа көпіршіктері болмауы керек,сұйықтық барлық кеңістікті жауып тұруы қажет және әйнектің шетіне шықпау қажет. Препаратты құрғақ және иммерциялық жүйеде де көруге болады.