Работа посвящена изучению строения и функций теломер и теломеразы, изучению их влияния на клеточное строение, экспрессии теломераз в нормальных клетках человека, а также изучению теломеразной активности и длины теломер в опухолевых клетках.
Актуальность работы заключается в изучении влияния фермента теломеразы на развитие опухолевых клеток, изучении возможностях процесса беспрерывного деления благодаря деятельности теломеразы.
Также актуальность работы заключается в изучении процессов старения как организма в целом, так и клетки. Работа дает возможность понять как происходит недорепликация концевых участков ДНК, какие процессы происходят в клетке для её деления, какие ферменты и белки участвуют в этих процессах.
Целью работы является изучение механизмов, сопровождающих деление клетки, изучение влияния теломеразы на внутриклеточные процессы и связь между теломеразой, раковыми клетками и старением клетки.
Теломеры и теломераза
Теломеры (от др.греч. τέλος — конец и μέρος — часть) — концевые участки хромосом. Теломерные участки хромосом характеризуются отсутствием способности к соединению с другими хромосомами или их фрагментами и выполняют защитную функцию. У большинства организмов теломерная ДНК представлена многочисленными короткими повторами. Их синтез осуществляется необычным РНК-содержащим ферментом теломеразой.
Существование специальных структур на концах хромосом было постулировано в 1938 году классиками генетики, лауреатами Нобелевской премии Барбарой Мак-Клинток и Германом Мёллером. Независимо друг от друга они обнаружили, что фрагментация хромосом (под действием рентгеновского облучения) и появление у них дополнительных концов ведут к хромосомным перестройкам и деградации хромосом. В сохранности оставались лишь области хромосом, прилегающие к их естественным концам. Лишенные концевых теломер, хромосомы начинают сливаться с большой частотой, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям. Следовательно, заключили они, естественные концы линейных хромосом защищены специальными структурами. Г. Мёллер предложил называть их теломерами.
У большинства эукариот теломеры состоят из специализированной линейной хромосомной ДНК, состоящей из коротких тандемных повторов. В теломерных участках хромосом ДНК вместе со специфически связывающимися с теломерными ДНК-повторами белками образует нуклеопротеидный комплекс — конститутивный (структурный) теломерный гетерохроматин. Теломерные повторы — весьма консервативные последовательности, например повторы всех позвоночных состоят из шести нуклеотидов TTAGGG, повторы всех насекомых — TTAGG, повторы большинства растений — TTTAGGG.
В последующие годы выяснилось, что теломеры не только предотвращают деградацию и слияние хромосом (и тем самым поддерживают целостность генома хозяйской клетки), но и, по-видимому, ответственны за прикрепление хромосом к специальной внутриядерной структуре (своеобразному скелету клеточного ядра), называемой ядерным матриксом . Таким образом, теломеры играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра.
У дрожжей повторяющиеся блоки в теломерной ДНК заметно длиннее, чем у простейших, и зачастую не столь регулярные. Каково же было удивление ученых, когда оказалось, что теломерная ДНК человека построена из TTAGGG-блоков, то есть отличается от простейших всего лишь одной буквой в повторе. Более того, из TTAGGG-блоков построены теломерные ДНК (вернее, их G-богатые цепи) всех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб. Столь же универсален теломерный ДНК-повтор у растений: не только у всех наземных растений, но даже у их весьма отдаленных родственников – морских водорослей он представлен последовательностью TTTAGGG. Впрочем, удивляться здесь особенно нечему, так как в теломерной ДНК не закодировано никаких белков (она не содержит генов), а у всех организмов теломеры выполняют универсальные функции.
1.1.Функции теломер:
1. Участвуют в фиксации хромосом к ядерному матриксу, обеспечивая правильную ориентацию хромосом в ядре.
2.Соединяют друг с другом концы сестринских хроматид, образующихся в хромосоме после S-фазы. Структура теломер однако допускает расхождение хроматид в анафазе. Мутация гена теломеразной РНК с изменением нуклеотидной последовательности теломер приводит к нерасхождению хроматид.
3. Предохраняют от недорепликации генетические значимые отделы ДНК в отсутствие теломераз.
4.Стабилизируют в присутствии теломераз концы разорванных хромосом путем добавления к ним теломер с возможностью функционирования. Примером является восстановление функции гена α – талассемией путем добавления теломер к точкам разрыва длинного плеча 16 хромосомы.
5. Влияют на активность генов. Гены, расположенные рядом с теломерами, функционально менее активны(репрессированы). Данный эффект носит название транскрипционного молчания или сайленсинга. Укорочение теломер приводит к отмене эффекта положения генов с активацией прителомерных генов. В основе сайленсинга может лежать действие белков( Rap1, TRF1), взаимодействующих с теломерами.
6. Выступают в качестве регулятора количества клеточных делений. Каждое деление клетки сопровождается укорочением теломеры на 50-65 пар нуклеотидов. В отсутствие теломеразной активности количество делений клетки будет определяться протяженностью оставшихся теломер.
Известно, что ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю цепь ДНК, прочитывают родительскую цепь в направлении от ее 3′-конца к 5′-концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется в направлении от 5′ к 3′. В противоположном направлении синтез цепи ДНК фермент катализировать не может. Кроме того, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК-праймера – короткой РНК-затравки, комплементарной ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК заполняются ДНК-полимеразой. Однако на 3′-конце ДНК такой пропуск заполнен быть не может, и поэтому 3′-концевые участки ДНК остаются однотяжевыми, а их 5′-концевые участки – недореплицированными. Отсюда ясно, что каждый цикл репликации хромосом будет приводить к их укорочению и прежде всего будет сокращаться длина теломерной ДНК.
Первым на проблему “концевой недорепликации ДНК” обратил внимание А.М. Оловников в 1971 году. Он высказал гипотезу о том, что потеря концевых последовательностей ДНК вследствие их недорепликации ведет к старению клетки. Иными словами, предполагалось, что процесс укорочения теломер и есть тот часовой механизм, который определяет репликативный потенциал “смертной” клетки, и когда длина теломер становится угрожающе короткой, этот механизм предотвращает дальнейшее деление клетки. А.М. Оловников предположил также, что в нестареющих клетках (а к ним кроме раковых относятся зародышевые, стволовые и другие генеративные клетки) должна существовать специализированная ферментативная система, которая контролирует и поддерживает длину теломерной ДНК.
Теломераза.
Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК (TTAGGG у позвоночных) к 3′-концу цепи ДНК на участках теломер, которые располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках. Теломеры содержат уплотненную ДНК и стабилизируют хромосомы.
Теломераза была впервые обнаружена в 1985 году у равноресничной инфузории Tetrahymena thermophila. Впоследствии она была обнаружена в дрожжах, растениях, животных, в.т.ч. яичниках человека и иммортализованных (бессмертных) линиях раковых клеток Hela.
Теломераза является ДНК-полимеразой, достраивающей 3′-концы линейных молекул ДНК хромосом короткими(6-8 нуклеотидов), повторяющимися последовательностями(у позвоночных она представлена нуклеотидами ТТАГГГ). Теломераза называется также ДНК-нуклеотидилэкзотрансферазой или теломерной терминальной трансферазой. Она состоит из белков и РНК, выполняющей роль матрицы для удлинения молекулы ДНК повторами нуклеотидов. Длина теломеразной РНК составляет от 150(простейшие) до 1400 нуклеотидов у дрожжей. У человека ее протяженность составляет 450 нуклеотидов.
Принцип действия теломеразы основан на удлинении не вновь синтезированной дочерней цепи, а материнской цепи ДНК. Процесс удлинения(достраивания) материнской(матричной) цепи ДНК теломеразой происходит до того, как эндонуклеазы отщепляет концевые нуклеотиды дочерней цепи.
По составу теломерных повторов в теломерах ДНК различают Г-цепь ( гуаниновая цепь) и Ц-цепь (цитозиновая цепь) . Обе цепи входят в состав двуцепочной молекулы ДНК. Теломераза удлиняет Г-цепь каждой теломеры.
РНК, содержащаяся в составе теломеразы, имеет матричный участок с помощью которого теломераза распознает теломерный повтор. После распознавания теломеры и связывания теломеразы с молекулрй ДНК последовательность оснований в составе молекулы полимеразы: 5′-ЦААЦЦЦАА-3′ синтезирует последовательность, комплиментарную с последовательностью в теломерном повторе: 5′-ТТГГГГ-3′. Нуклеотиды ААЦ в РНК теломеразы остаются неспаренными, к ним присоединяются нуклеотиды ТТГ молекулы ДНК. Данный процесс осуществляется путем перемещения теломеразы на самый конец теломерной последовательности ДНК. В результате этого конец материнской ДНК удлиняется на повтор нуклеотидов-ТТГГГГТТГ.
Процесс образования нового теломерного повтора носит название элонгации.
Образование следующего теломерного повтора происходит путём перемещения теломеразы( вместе с РНК) на один повтор к 3′-концу удлиняемой цепи ДНК. Процесс перемещения теломеразы носит название транслокации. Таким образом процесс наращивания теломерного участка материнской хромосомы включает в себя этапы элонгации и транслокации теломеразы.
В конечном итоге теломераза может удлинить цепь ДНК на несколько десятков или сотен теломерных повторов(количество повторов зависит по-видимому от видовой принадлежности организма и количества делений,пройденных той или иной клеткой).
На удлиненной части ДНК достраивается дочерняя цепь ДНК. Мутации в теломерной РНК приводят не к синтезу ошибочных нуклеотидов, а к утрате активности всей теломеразы.
Следует особо подчеркнуть, что теломераза функционирует и восстанавливает дочернюю молекулу ДНК только в генеративных, раковых и линиях иммортализованных(бессмертных) клеточных культурах.
В соматических клетках теломеразная активность отсутствует и, следовательно, теломеры соматических клеток постепенно, после каждой репликации, укорачиваются.
В этой связи было высказано предположение, что постепенное укорочение ДНК хромосом в процессе репликации, может лежать в основе ограниченного числа делений клеток, культивируемых in vitro. Данное ограничение носит название «лимита Хейфлика». Хейфлик показал в начале 60-х годов XX века зависимость числа клеточных делений от возраста человека. У новорожденных соматические клетки могут делиться 80-90 раз, а у 70-летних людей- только 20-30 раз.
Укорочение теломерных концов хромосом можно считать молекулярным индикатором количества делений, но не старения клетки.
Прекращение работы теломеразы, наблюдаемое в большинстве дифференцированных соматических клеток, является свидетельством их зрелости и одновременно специфическим сигналом для запуска процессов, приводящих клетки к естественной гибели(апоптозу).
Результаты изучения теломеразной активности в соматических клетках предполагают наличие трех различных уровней регуляции.
Во-первых активная теломераза ни разу не была обнаружена у большинства типов терминально дифференцированных нормальных соматических клеток , таких как фибробласты, независимо от того, находились ли они в стадии покоя или пролиферации. Таким образом, принадлежность клеток к определенному типу, очевидно, является первичной детерминантой теломеразной активности. Многие популяции нормальных клеток, обладающих теломеразной активностью (среди них половые клетки, клетки эмбриональной ткани , кроветворные клетки-предшественницы, клетки кожного эпидермиса и клетки волосяных фолликулов, характеризуются как содержащие стволовые клетки. Стволовые клетки обладают как способностью обновляться, так и способностью дифференцироваться во множество типов клеток, формирующих ткани. Основываясь на данных проточной цитометрии, позволяющей отобрать отдельную клетку, Моррисон с соавторами высказали предположение о том, что теломеразная активность тесно связана со способностью клеток к самообновлению. Однако процесс превращения наивных Т-клеток в Т-клетки памяти явно относится к дифференцировке, а не к самообновлению. Неизвестно, всегда ли остается верной гипотеза о том, что теломераза является ферментом самообновляющихся клеток. Важной задачей остается изучение отдельных стадий, во время которых теломераза активируется в различных тканях.
Высокая теломеразная активность наблюдается в половых клетках человека в течение всей его жизни. Соответственно их теломеры состоят из наибольшего числа ДНК-повторов и содержат все необходимые белки для нормальной пролиферации клеток. Аналогичная ситуация наблюдается и для стволовых клеток. Стволовые клетки делятся неограниченно долго, однако у стволовой клетки всегда есть возможность дать две дочерние клетки, одна из которых останется стволовой (“бессмертной”), а другая вступит в процесс дифференцировки. Благодаря этому стволовые клетки служат постоянным источником разнообразных клеток организма. Например, стволовые клетки костного мозга дают начало гемопоэзу – процессу образования клеток крови, а из базальных клеток эпидермиса происходят разнообразные клетки кожного покрова. Как только потомки половых или стволовых клеток начинают дифференцироваться, активность теломеразы падает и их теломеры начинают укорачиваться. В клетках, дифференцировка которых завершена, активность теломеразы падает до нуля, и с каждым клеточным делением они с неизбежностью приближаются к состоянию сенесенса (перестают делиться). Вслед за этим наступает кризис, и большинство клеток погибают . Эта картина характерна для подавляющего большинства известных культур клеток эукариот. Однако и здесь есть редкие, но важные исключения: теломеразная активность обнаруживается в таких “смертных” клетках, как макрофаги и лейкоциты.
Недавно было установлено, что нормальные соматические клетки потому лишены теломеразной активности, что в них полностью подавлена экспрессия гена ее каталитической субъединицы (обратной транскриптазы). Другие же составляющие теломеразы, включая теломеразную РНК, образуются в этих клетках, хотя и в меньших количествах, чем в их “бессмертных” прародителях, но постоянно (конститутивно). Открытие этого важного факта Дж. Шеем, В. Райтом и их сотрудниками и стало основой для той сенсационной работы по преодолению “лимита Хейфлика”.
В нормальные соматические клетки были внесены гены теломеразной обратной транскриптазы с помощью специальных векторов, сконструированных из вирусных ДНК. Уровень экспрессии гена в эукариотической клетке зависит от многих факторов, в том числе от белков – факторов транскрипции, связывающихся со специализированными участками ДНК, расположенными в хромосоме по соседству с этим геном. Геномы вирусов, которым нужно быстро размножиться в клетке-хозяине, несут в себе участки ДНК, способные во много раз усилить экспрессию того или иного гена. Исследователи позаботились о том, чтобы в их конструкциях ген теломеразной обратной транскриптазы человека оказался в окружении именно таких участков вирусной ДНК. Результаты их экспериментов можно суммировать кратко: клетки, в которых теломераза поддерживала длину теломер на уровне, характерном для молодых клеток, продолжали делиться и тогда, когда контрольные клетки (без теломеразы) старели и умирали.
В этой и аналогичной ей работах особенно тщательно контролируется отсутствие в культуре клеток раковых клеток. Известно, что клетки большинства исследованных на сегодня раковых опухолей характеризуются достаточно высокой активностью теломеразы, которая поддерживает длину теломер на постоянном уровне. Этот уровень заметно ниже, чем, например, у эмбриональных клеток, но он достаточен, чтобы обеспечить безграничное деление раковых клеток в культуре. Существует гипотеза, у которой немало сторонников, предполагающая, что потеря теломеразной активности соматическими клетками современных организмов есть благоприобретенное в процессе эволюции свойство, уберегающее их от злокачественного перерождения.
Когда клетки в культуре приближаются к пределу Хейфлика, старение может быть замедлено деактивацией генов, которые кодируют белки, подавляющие образование опухолей. Это, в частности, белок, называемый p53, и белок ретинобластомы (pRb). Измененные таким образом клетки рано или поздно достигают состояния, называемого «кризисом», когда большая часть клеточной культуры умирает. Иногда, однако, клетка не перестает делиться при достижении кризиса. Обычно в это время теломеры полностью разрушены и состояние хромосомы ухудшается с каждым делением.
Оголенные концы хромосом распознаются как разрывы обеих цепей ДНК. Повреждения такого рода обычно устраняются путем соединения разорванных концов. Однако в данном случае соединенными могут оказаться концы разных хромосом, так как они более не защищены теломерами. Это временно позволяет решить проблему отсутствия теломер, однако во время анафазы клеточного деления сцепленные хромосомы разрываются на части случайным образом, что приводит к большому количеству мутаций и хромосомных аномалий.
По мере продолжения этого процесса геном клетки повреждается все больше. Наконец, наступает момент, когда либо объем поврежденного генетического материала становится достаточным для гибели клетки (путем запрограммированной клеточной смерти – апоптоза), либо происходит дополнительная мутация, активирующая теломеразу.
После активации теломеразы некоторые виды клеток становятся бессмертными: их хромосомы не становятся менее стабильными вне зависимости от числа клеточных делений, и процесс клеточной смерти не запускается. Многие раковые клетки считаются бессмертными, поскольку активность генов теломеразы в них позволяет им делиться практически бесконечно, что и является причиной образования опухолей.
Хороший пример бессмертия раковых клеток — это клетки HeLa, изначально полученные из опухоли шейки матки Генриетты Лекс (Henrietta Lacks, отсюда название культуры HeLa) в 1951 г. Эта культура по сей день используется в лабораторных исследованиях. Клетки Hela в самом деле бессмертны: по оценкам ежедневно производится несколько тонн этих клеток, причем все они являются потомками нескольких клеток, извлеченных из опухоли Г. Лекс.
В модельных клетках вызывались различные мутации, которые встречаются в разных видах человеческих раковых клеток. Это позволило выявить несколько сочетаний мутаций, которые являются достаточными для образования опухолевых клеток из различных их видов.
Собственно сочетания мутаций различается в зависимости от вида клеток. Однако большинство из них содержат следующие изменения:
• активацию теломеразы;
• нарушение цикла белка p53;
• активацию прото-онкогенов Ras, Myc или других;
• нарушение формирования фосфатазы белка PP2A.
Эти изменения приводят к отключению механизма гибели клетки в результате разрушения хромосом или апоптоза. Кроме того клетка начинает непрерывно делиться.
Эта модель рака, созданная в клеточной культуре, проливает свет на роль теломеразы в формирование опухолей у человека. Активация теломеразы наблюдается в 90 % всех опухолей. Это позволяет заключить, что предоставляемое ею бессмертие является ключевым фактором в развитии рака.
Опухоли, в клетках которых TERT не активировался, в основном использовали другой механизм сохранения теломер, называемый ALT (альтернативное удлинение теломер, alternative lengthening of telomeres). Детали этого механизма неизвестны.
Как показано в работе Элизабет Блекбёрн и др., теломераза также участвует в регуляции активности 70 генов, которые участвуют либо подозреваются в участии в образовании и развитии раковых опухолей. Кроме того, она активирует гликолиз, что позволяет раковым клеткам использовать сахара для поддержания заданной скорости роста и деления (эти скорости сравнимы со скоростями роста клеток в зародыше).
Заключение
По данной работе и по изученному мной материалу можно сделать вывод, что процесс старения не только организма, но и клетки – это исключительно сложный комплекс изменений во множестве биохимических реакций, и его вряд ли можно повернуть вспять, воздействуя только на какую-то одну из них. Наш организм сложен и ещё не изучен полностью. Теломераза, которая может вновь активироваться и бесконечно обновлять наши клетки своим «бессмертным даром» порождает развитие опухолевых клеток в результате чего человеческий организм погибает.
Многие интересные и сложные процессы предстоит открыть учёным, чтобы понять как можно порождение бессмертных опухолевых клеток направить на развитие более нужных и важных вещей, таких как бесконечное деление клеток кожи людей с сильными степенями ожогов или серьёзными повреждениями кожного покрова. Возможность теломеразы вновь активироваться под влиянием мутаций вызывает огромный интерес и возможно это одно из будущих направлений науки и медицины.
