1Важнейше задаче медицинско микробиологи являетс вы явлени микробов-возбудителе инфекционны болезней. Поэто метод микробиологи направлен н изучени свойст ми кробов, обусловливающи и патогенно действие, и процессы, которы возникаю по и влияние в организм человек и жи вотных. основны метода микробиологи относятся: • микроскопически — изучени морфологи микробо с ис пользование специально микроскопическо техники; • бактериологически (культуральный) — получени чисты культу микробо и изучени и биологически свойств, по зволяющи провест идентификацию, т.е. определение, вид микроба; • серологически — выявлени антите к возбудителя в био логически жидкостя организм больног (чаш в сыворотк крови; о лат. serum — сыворотка); • аллергологически — оценк аллергически феноменов, воз никающи в организм человек (н коже, слизисты оболоч 20 Глав 1 ка ил в крови) по действие компоненто ил цельны клето микроба-возбудителя; • биологически — моделировани инфекционны процессо лабораторны животны ил курины эмбрионах; • хемотаксономически — изучени микробо п продукта и жизнедеятельност непосредственн в организм (бе пред варительног культивировани н питательны средах). Дл этог применяю газову и газожидкостну хроматографию; • молекулярно-биологически — изучени состав микробны нуклеиновы кисло с помошь полимеразно цепно реак ции, сиквенировани и гибридизаци ДНК,
2вс клеточны ор ганизм разделит н дв царства: прокариото (о греч. пр — до, карио — ядро, т.е. доядерные) и эукариото (э — хорошо, т.е. с настоящим, истинны ядром). Микроб ест в обои царствах, а бактери принадлежа тольк к царств прокариотов. Принципиально отличи прокариото о эукариото заключа етс з том, чт эукариот имею четк дифференцированно ядро, отграниченно о цитоплазм ядерно мембраной. Таког ядр пр кар оти е ко клетк нет. У не ест анало — нуклеоид, представляющи собо двунитевую, ковалентно-замкнуту моле кул ДНК. Е част называю хромосомой, хотя, в отличи о хро мосо эукариотов
систематика (таксономия) – наука о многообразии и взаимосвязях между организмами. Одна из задач систематики – распределение (классификация) множестваорганизмов по группам ( таксонам ). Различают следующие таксономи- ческие категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и др. В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны — группы организмов, объединенные по определенным однородным свойствамд. Одной из основных таксономических категорий является вид (species). Вид — это совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода
№ 3 Принципы классификации бактерий. Для бактерий рекомендованы следующие таксономические категории: класс, отдел, порядок, семейство, род, вид. Название вида соответствует бинарной номенклатуре, т. е. состоит из двух слов. Например, возбудитель сифилиса пишется как Treponemapallidum. Первое слово — название рода и пишется с прописной буквы, второе слово обозначает вид и пишется со строчной буквы. При повторном упоминании вида родовое название сокращается до начальной буквы, например: Т. pallidum. Бактерии относятся к прокариотам, т. е. доядерным организмам, поскольку у них имеется примитивное ядро без оболочки, ядрышка, гистонов, а в цитоплазме отсутствуют высокоорганизованные органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и др.). Бактерии делят на 2 домена: «Bacteria» и «Archaea». В домене «Bacteria» можно выделить следующие бактерии: 1) бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамотрицательные; 3 2) бактерии с толстой клеточной стенкой, грамположительные; 3) бактерии без клеточной стенки (класс Mollicutes — микоплазмы) Архебактерии не содержат пептидогликан в клеточной стенке. Они имеют особые рибосомы и рибосомные РНК (рРНК). Среди тонкостенных грамотрицательных эубактерий различают: • сферические формы, или кокки (гонококки, менингококки, вейлонеллы); • извитые формы — спирохеты и спириллы; • палочковидные формы, включая риккетсии. К толстостенным грамположительным эубактериям относят: • сферические формы, или кокки (стафилококки, стрептококки, пневмококки); • палочковидные формы, а также актиномицеты (ветвящиеся, нитевидные бактерии), коринебактерии (булавовидные бактерии), микобактерии и бифидобактерии. Тонкостенные грамотрицательные бактерии: Менингококки, гонококки, Вейлонеллы, Палочки, Вибрионы, Кампилобактерии, Хеликобактерии, Спириллы, Спирохеты, Риккетсии, Хламидии. Толстостенные грамположительные бактерии: Пневмококки, Стрептококки, Стафилококки, Палочки, Бациллы, Клостридии, Коринебактерии, Микобактерии, Бифидобактерии, Актиномицеты.
Различаю нескольк основны фор бактерий: кокковидные, палочковидные, извиты и ветвящиес (рис. 2.1). Сферические формы, или кокки — шаровидны бактери разме ро 0,5—1 мкм, которы п взаимном расположени делятс н микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцин и стафилококки. Микрококк (о греч. micros — малый) — отдельн расположен ны клетки. Диплококк (о греч. diploos — двойной), ил парны кокки, располагаютс парам (пневмококк, гонококк, менингококк), та ка клетк посл делени н расходятся. Пневмокок (возбуди тел пневмонии) имее с противоположны сторо ланцетовидну форму, а гонокок (возбудител гонореи) и менингокок (возбудител эпидемическог менингита) имею форм кофейны зерен, обрашенны вогнуто поверхность дру к другу. Стрептококк (о греч. streptos — цепочка) — клетк округло ил вытянуто формы, составляющи цепочк вследстви делени клето в одно плоскост и сохранени связ межд ним в мест деления. Сарцин (о лат. sarcina — связка, тюк) располагаютс в вид пакето и 8 кокко и более, та ка он оС^азуютс пр делени клетк в тре взаимн перпендикулярны плоскостях. Стафилококк (о греч. staphyle — виноградна гроздь) — кок ки, расположенны в вид грозд виноград в результат делени разны плоскостях. Палочковидные бактерии различаютс п размерам, форм кон цо клетк и взаимном расположени клеток. Длин клето 1 — 10 мкм, толщин 0,5—2 мкм. Палочк могу быт правильно Морфологи и классификаци микробо 33 (кишечна палочк и др.) и неправильно булавовидно (корине бактери и др.) формы. К наиболе мелки палочковидны бак терия относятс риккетсии. Конц палоче могу быт ка б обрезанным (сибиреязвен на бацилла), закругленным (кишечна палочка), заостренным (фузобактерии) ил в вид утолщения. В последне случа палоч похож н булав (коринебактери дифтерии). Слегк изогнуты палочк называютс вибрионам (холерны вибрион). Большинств палочковидны бактери располагает беспорядочно, та ка посл делени клетк расходятся. Есл посл делени клетк остаютс связанным общим фрагмента клеточно стенк и н расходятся, т он располагаютс по угло дру к друг (коринебактери дифтерии) ил образую це почк (сибиреязвенна бацилла). Извитые формы — спиралевидны бактерии, которы бываю дву видов: спирилл и спирохеты. Спирилл имею ви штопо рообразн извиты клето с крупным завитками. К патогенны спирилла относятс возбудител содок (болезн укус крыс), а такж кампилобактери и хеликобактерии, имеющи изгибы, на поминающи крыль летяще чайки. Спирохет представляю тонки длинны извиты бактерии, отличающиес о спирил бо ле мелким завиткам и характеро движения. Особенност и строени описан ниже. Ветвящиеся — палочковидны бактерии, которы могу имет разветвлени в форм латинско букв Y, встречающиес у бифи добактерий, такж быт представленным в вид нитевидны раз ветвленны клеток, способны переплетаться, образу мицелий, чт наблюдаетс у актиномицет.
4Цитоплазматическая мембрана
Цитоплазматическая мембрана при электронной микроскопии ультратонких срезов представляет собой трехслойную мембрану (2 темных слоя толщиной по 2,5 нм разделены светлым – промежуточным). По структуре она похожа на плазмалемму клеток животных и состоит из двойного слоя фосфолипидов с внедренными поверхностными, а также интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны. При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки) цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты — впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые мезосомами. Менее сложно закрученные структуры называются внутрицитоплазматическими мембранами.
Цитоплазма
Цитоплазма состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений и многочисленных мелких гранул — рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков. Рибосомы бактерий имеют размер около 20 нм и коэффициент седиментации 70S, в отличие от 80S-рибосом, характерных для эукариотических клеток. Рибосомные РНК (рРНК) – консервативные элементы бактерий («молекулярные часы» эволюции). 16S рРНК входит в состав малой субъединицы рибосом, а 23S рРНК – в состав большой субъединицы рибосом. Изучение 16S рРНК является основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов.
В цитоплазме имеются различные включения в виде гранул гликогена, полисахаридов, бета-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они являются запасными веществами для питания и энергетических потребностей бактерий. Волютин обладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул. Характерное расположение гранул волютина выявляется у дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки.
Нуклеоид
Нуклеоид — эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК.
Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности – плазмиды, представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК.
Мезосомы – мембранные структуры прокариот, выполняющие функциюгенерации энергии, аналоги митохондрий эукариот.
5Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos— стенка). В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид. Функции клеточной стенки: 1. Обусловливает форму клетки. 2. Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление. 3. Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества. 4. Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ. Метод выявления клеточной стенки – электронная микроскопия, плазмолиз. L-формы бактерий, их медицинское значение L-формы – это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки (протопласт +/- остаток клеточной стенки), поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток. Способны к размножению
6Окраска по Граму. Методика: 1) окрасить мазок генцианвиолетом ( 2 минуты,через фильтровальную бумагу); 2) бумагу удалить, оставшуюся краску слить; 3) окрасить мазок раствором Люголя (1 минута); 4) раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло); 5) тщательно смыть спирт водой; 6) окрасить водным фуксином (2 минуты); 7) промыть водой и высушить. Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – в красный
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры. Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos— стенка). В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид.
15Окраска по Граму. Методика: 1) окрасить мазок генцианвиолетом ( 2 минуты,через фильтровальную бумагу); 2) бумагу удалить, оставшуюся краску слить; 3) окрасить мазок раствором Люголя (1 минута); 4) раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло); 5) тщательно смыть спирт водой; 6) окрасить водным фуксином (2 минуты); 7) промыть водой и высушить. Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – в красный
Метод Ожешко. 1) нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты); 2) слить кислоту, промыть водой, высушить; 3) зафиксировать в пламени; 4) окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Н
- Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.). Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав. По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем до- бавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки осо- бого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застыв- шем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными. По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические. К основнымотносятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — пита- 11 тельный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.
Требования, предъявляемые к питательным средам. Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава
20 Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде и т. д. Дифференциально-диагностическиепитательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) мик- роорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохи- мической активности вследствие неодинакового набора ферментов. Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов. В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы(МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально- диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях..
