Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МКАТ в иммунологии

Введение

Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине, в частности в иммунологии. Данное понятие является очень актуальным для изучения в настоящее время, так как занимает достаточно высокую позицию в лечении онкологических заболеваний. Задачами моей работы я ставлю раскрытие понятий моноклональных антител, гибридомной технологии, а так же историю и принципы получения моноклональных антител, гибридом, рассмотрение основных областей применения МКАТ в иммунологии. Целью работы является понимание и донесение данных понятий в максимально доступной и интересной форме.

Понятие моноклональных антител

Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (в основном белки и полисахариды), который антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается на -mab (от английского «monoclonal antibody»). Примерами лекарственных средств на основе моноклональных антител являются ипилимумаб (Ервой), использующийся для лечения меланомы, трастузумаб (Герцептин, Гертикал), применяющийся в лечении рака молочной железы и ритуксимаб, показавший свою эффективность против хронического лимфолейкоза.

Моноклональные антитела (МАТ) секретируются иммунными клетками, происходящими от единственной антителообразующей клетки. Поэтому МКАТ направлены только против определенного эпитопа иммуногенного вещества, так называемой “антигенной детерминанты”.

История развития моноклональных антител

История получения и применения моноклональных антител уходит своими корнями в исследования конца 19 века. С тех пор, за прошедшие более чем сто лет, моноклональные антитела успели несколько раз совершить революцию в медицине, полностью перевернув представления о возможностях лекарственной терапии.

Первый шаг — иммунизация антителами животных (XIX в. – начало XX в.)

Ученых с давних пор интересовал вопрос о том, каким образом организм создает множество различных антител, обладающих уникальной специфичностью в отношении чужеродных веществ (антигенов), и каким образом эти антитела работают. Один из первых шагов к ответу на этот вопрос был сделан группой ученых, работавших в Институте инфекционных болезней в Берлине и открывших методы лечения дифтерии. В конце XIX века дифтерия у детей считалась смертельным неизлечимым заболеванием. Врач иммунолог-бактериолог Эмиль Беринг (Emil Behring) предположил, что лечение дифтерии может быть успешным в случае проявления естественной защитной реакции человеческого организма, а именно, если секретируемый дифтерийными бактериями токсин нейтрализовать. В 1890 г. Беринг совместно с японским ученым Сибасабуро Китасато установили, что неиммунизированные животные могут быть защищены от токсина дифтерийных бактерий с помощью инъекции антитоксина (антитоксической сыворотки) иммунизированных животных. В 1894 г. в период эпидемии дифтерии, унесшей жизни 50 000 детей в Германии, были произведены первые 25 000 доз антитоксина для применения в лечении людей. В 1901 г. Эмилю Берингу была присуждена Нобелевская премия за работу по сывороточной терапии. Однако на тот момент эффективность сыворотки была достаточно низкой, поскольку антитела в сыворотке вырабатывались клетками животных, а не самого пациента и вызывали лишь пассивный иммунитет. Антитоксин необходимо было вводить сразу после инфицирования, иначе было слишком поздно.

Еще одним примером использования антисыворотки в терапии людей стали исследования Чарльза Ричета (Charles Richet) и Жюля Эрикура (Jules Héricourt), применявших для лечения онкологических заболеваний антисыворотку, полученную путем иммунизации животных тканями саркомы. С середины 30-х годов практика пассивной иммунизации сошла на нет в связи с открытием антибиотиков широкого спектра действия.

Второй шаг — расшифровка структуры моноклональных антител (30–70-е гг. XX в.)

(Рисунок 1. Структура антитела, за которую ученые Родни Портер и Джеральд Эдельман в 1972 г. получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине)

В 30-х гг. появились ультрацентрифуги, позволявшие разделять антитела по размеру и форме. В 40-х гг. ученые научились сортировать антитела по электрическому заряду и размеру. Однако дальнейшая расшифровка структуры антитела была пока недоступна из-за их большого размера, в 20 раз превышавшего размер молекул белков, структуры которых к тому времени уже были расшифрованы. Только в 1962 г. на базе многочисленных исследований, проводившихся различными учеными, Родни Портер (Rodney Porter) расшифровал основную структуру антител, стало известно, что антитело состоит из легкой и тяжелой цепи. Позже Родни Портеру совместно с Джеральдом Эдельманом (Gerald Edelman) удалось определить последовательность 1300 аминокислот, входящих в белковую цепь антитела, производимого клетками раковой опухоли миеломы. В то время это была самая большая расшифровка аминокислотной последовательности, за что в 1972 году ученые получили Нобелевскую премию. В результате исследований Портера и Эдельмана стало известно, что антитело имеет форму буквы Y, в которой нижняя часть (тяжелая цепь) имеет постоянную структуру для разных антител, а плечи (легкие цепи) значительно различаются у различных антител. Именно эти плечи отвечают за связывание антитела с антигеном и его нейтрализацию.

Третий шаг — разработка первой технологии синтеза антител (70–80-е гг. XX в.)

К 1970-м годам уже были известны некоторые важные моменты о том, каким образом в организме человека вырабатываются антитела. В частности, было известно, что за продуцирование антител отвечают В-лимфоциты, причем каждый В-лимфоцит может вырабатывать только одно специфическое антитело, при этом он редуплицируется и за счет этого быстро производит большое количество идентичных по структуре антител — так называемых моноклональных, то есть произошедших от одной клетки-предшественницы.

Добиться столь же быстрой выработки антител в лабораторных условиях удалось в 1975 году ученым Георгу Кёлеру (Georges Köhler) и Сезару Мильштейну (César Milstein). На тот момент была исследована способность клеток раковой опухоли миеломы быстро производить идентичные самим себе клетки. Кроме того, существовала возможность выделения антителопродуцирующих клеток из организма животных. Технология Кёлера и Мильштейна включала несколько этапов: у мыши вырабатывался иммунитет к известному антигену, затем из ее селезенки выделялись антителопродуцирующие клетки, эти клетки с помощью особой технологии соединялись с клетками миеломы с получением гибридомы, клетки которой непрерывно в большом количестве синтезировали антитела против известного антигена. Эта методика произвела переворот в изучении антител, поскольку позволила получать антитела с удивительно точным соответствием определенной структуре. В дальнейшем технология была усовершенствована, и в 1984 году Кёлер, Мильштейн и датский иммунолог Нильс Ерне (Niels Jerne) получили Нобелевскую премию за участие в создании антител, которые можно использовать для диагностических исследований и создания лекарственных средств. В дальнейшем было разработано множество технологий, позволивших усовершенствовать синтез антител за счет развития технологий рекомбинации ДНК, технологий клонирования клеток и других достижений генной инженерии.

Четвертый шаг — применение искусственно синтезированных антител для лечения заболеваний (80-е гг. XX в.)

При первых попытках применения для лечения людей антител, искусственно синтезированных из клеток животных, ученые столкнулись с трудностями. В 1979 г. впервые в мире ученые Филип Сташенко (Philip Stashenko) и Ли Надлер (Lee Nadler) применили искусственно синтезированные моноклональные антитела, полученные из клеток мышей, против антигенов, которые вырабатываются на поверхности клеток раковых опухолей. Однако было выявлено, что мышиные антитела в незначительной степени связывались с опухолевыми антигенами и воспринимались организмом как чужеродные клетки.

С 1986 г. на фармацевтическом рынке началась реализация препарата компании Janssen «Ортоклон ОКТ3» (муромонаб), который позволяет купировать реакцию отторжения трансплантата почки, оказывая избирательное иммуноподавляющее действие. Препарат имеет полностью мышиное происхождение, то есть синтезируется мышиными гибридомами, полученными слиянием мышиной миеломы и мышиных В-лимфоцитов. Вскоре после выхода препарата на рынок стало ясно, что при длительном применении мышиных моноклональных антител в качестве лекарственных средств их эффективность снижалась. Это связано с тем, что мышиные белки являются иммуногенными для организма человека, то есть воспринимаются как чужеродные объекты. В связи с этим у пациентов, которым вводят мышиные антитела, быстро образуются человеческие антимышиные антитела (human antimurine antibody – HAMA). Образующиеся HAMA-антитела нейтрализуют эффект мышиных антител.

Пятый шаг — создание химерных антител (90-е гг. XX в.)

В начале 90-х гг. с использованием молекулярно-биологических методов, основанных на применении рекомбинантной ДНК, были созданы химерные антитела. В химерных антителах часть «мышиной» молекулы с помощью методов генной инженерии заменялась на участок человеческого происхождения, а часть оставалась фрагментом мышиного происхождения. Поскольку белковая последовательность химерных антител на 75% состояла из «человеческих» последовательностей аминокислот, то у пациентов, получавших химерные антитела, HAMA-антитела образовывались в значительно меньшем количестве, и это сделало препараты на основе химерных антител значительно более эффективными, чем на основе мышиных. В дальнейшем был выпущен целый ряд лекарственных средств на основе химерных антител: ритуксимаб, выпускаемый под брендами «Мабтера» и «Ритуксан», — для лечения раковых опухолей, «Ремикейд» (инфликсимаб) — для лечения болезни Крона, «Симулект» (базиликсимаб) — для профилактики острого отторжения трансплантата почки, «Реопро» (абциксимаб) — для профилактики стенокардии и острого инфаркта миокарда, а также другие препараты.

Разработка химерных антител позволила практически полностью отказаться от использования мышиных антител. Однако в некоторых случаях использование мышиных антител и сегодня остается оправданным. Из одобренных к применению лекарственных средств сегодня лишь три являются мышиными: «Ортоклон-ОКТ3» (муромонаб-CD3), «Зевалин» (ибритумомаб тиуксетан) и «Бексар» (тозитумомаб-йод 131). Два последних являются радиоактивно мечеными мышиными МАТ. Их функция заключается в доставке радиоизотопов к клеткам лимфомы. Наличие радиоактивной метки позволяет применять эти антитела в очень небольших количествах, поэтому иммуногенность, обусловленная мышиными последовательностями, в этом случае не так значима. То, что эти препараты включают именно мышиные, а не гуманизированные или человеческие формы делает их более эффективными, потому что гуманизированные формы могли бы связываться одновременно не только с клетками-мишенями, но и со здоровыми клетками, нанося им вред. Также к применению сегодня одобрен один препарат на основе крысино-мышиного МАТ — это препарат «Ремоваб» (катумаксомаб) для лечения злокачественного асцита.

Шестой шаг — создание гуманизированных и человеческих моноклональных антител (конец 90-х гг. XX в. — 2000-е гг. XXI в.)

В конце 90-х гг. с помощью методов генной инженерии удалось свести к минимуму процент мышиных последовательностей аминокислот в искусственно синтезируемых антителах, благодаря чему были получены гуманизированные антитела, еще в меньше степени вызывающие образование HAMA-антител у человека. Начиная с конца 90-х гг. на рынок было выпущено множество препаратов на основе гуманизированных антител. Например: «Зенапакс» (даклизумаб) — для профилактики отторжения после трансплантации почки, «Герцептин» (трастузумаб) — для лечения рака молочной железы и рака желудка, «Ксолар» (омализумаб) — для лечения атопической бронхиальной астмы и сезонного аллергического ринита, «Раптива» (эфализумаб) — для лечения псориаза, а также многие другие.

В 2000-х годах усовершенствованные методы генной инженерии наконец позволили добиться долгожданного результата и получить человеческие МАТ. В настоящее время человеческие МАТ чаще всего получают с помощью технологии трансгенных мышей (мышей, выведенных с использованием фрагментов чужеродной ДНК) или фагового дисплея (особый метод генной инженерии с использованием вирусов-бактериофагов). Например, сегодня для клинического применения одобрены такие препараты, созданные на основе человеческих МАТ, как «Бенлиста» (белимумаб) — для лечения красной волчанки, «Ервой» (ипилимумаб) — для лечения меланомы, «Симпони» (голимумаб) — для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита, болезни Бехтерева, а также другие препараты.

Еще один тип веществ, созданных методами генной инженерии для лечения пациентов, — это так называемые «белки слияния», в которых искусственно соединены два отдельных белка, зачастую с различными функциями. Например, на основе такого вещества создан препарат «Амевив» (алефацепт) моноклональные антитела при псориазе, орфанный препарат «Аркалист» (рилонацепт) — для лечения редких генетических аутовоспалительных заболеваний, относящихся к группе криопинсвязанных периодических синдромов, и другие препараты.

Гибридомы: определение и характеристика

Гибридома – клетка, получающаяся в результате сплавления В-клетки, продуцирующей антитела, и опухолевой клетки. Такие клетки могут быть клонированы и поддерживаться длительное время в культуре, продуцируя моноклональные антитела. Клетки гибридомы можно также инъецировать мыши, в результате чего образуются асциты, содержащие моноклональные антитела .

Методика, позволяющая получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител ( моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью была описана в 1975 году. Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время “гибридомная технология” является одним из основных направлений в биотехнологии.

Обычно при иммунизации в ответ на антиген происходит синтез различных антител, т.е. антисыворотка гетерогенна. Метод гибридизации соматических клеток позволил получать клоны гибридных клеток, гибридом, продуцирующих идентичные антитела к одной антигенной детерминанте, т.е. моноклональные антитела.

Продуцентами антител являются лимфоциты, причем различные лимфоциты образуют разные антитела. Однако лимфоциты характеризуются ограниченным сроком жизни в культуре. С другой стороны, известны злокачественные опухоли, миеломы, вырабатывающие большие количества аномальных иммуноглобулинов. Клетки миеломы хорошо размножаются в культуре и представляют собой “бессмертные” линии. Задача заключалась в том, чтобы выделить клоны клеток, продуцирующих один тип антител и при этом способных неограниченно долго размножаться. Впервые гибридомы, образованные слиянием культивируемых клеток миеломы с клетками селезенки иммунизированной мыши, были получены Келером и Мильштейном.

Использование клеток миеломы, мутантных по гену ГФРТ, позволило для выделения клонов применить среду HAТ . В настоящее время метод получения гибридом с различными модификациями используется для того, чтобы иметь моноклональные антитела к различным антигенам. Клоны, продуцирующие моноклональные антитела, могут быть размножены и заморожены. При введении их сингенным животным образуются асцитные опухоли, содержащие большие количества моноклональных антител. Такая возможность получения различных моноклопальных антител в настоящее время широко используется для решения многих задач практической медицины, в частности, в целях диагностики.

Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующие антитела одной специфичности. Полученные при слиянии нормальных лимфоцитов, продуцирующих антитела, с подходящей опухолевой линией B-клеток, гибридомы отбирают в культуральной среде, неспособной поддерживать рост родительских клеток. Путем последовательных разведений и пересевов получают одиночные клоны, которые можно выращивать в роллерных культурах или в форме асцита в брюшной полости мышей. В последнем случае удается получать особенно высокие титры моноклональных антител. При этом, естественно, все молекулы иммуноглобулинов, продуцируемые определенной гибридомой, идентичны: они относятся к одному классу и одному аллотипу, имеют одинаковыевариабельные области, структуру, идиотип, афинность и специфичность к данному эпитопу.

На современном этапе созданы десятки тысяч высокоафинных антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также низкомолекулярными антигенами. На их основе получены конъюгаты с различными функциональными соединениями, токсинами, ферментами, магнитными частицами, радиоактивными и рентгеноконтрастными атомами и т.п. Эти конъюгаты находят широчайшее применение в научных исследованиях, медицине, ветеринарии. Описаны примеры получения с помощью указанной технологии антител, обладающих каталитической активностью, так называемых абзимов.

Клетки миеломы, применяемые для получения гибридом и осуществляющие эффективную секрецию рекомбинантных белков, хорошо изучены в отношении экспрессии в них соответствующих рекомбинантных генов, введенных с помощью трансфекции.

Основные области применения МКАТ

Разработка и клиническое использование биологических препаратов, созданных на основе моноклональных антител – очень важное достижение. Первые моноклональные антитела использовали в основном с диагностической целью. Именно с помощью моноклональных антител к поверхностным молекулам определяют субпопуляционный состав лимфоцитов, проводят иммуногистохимические исследования для диагностики онкологических и аутоиммунных заболеваний при работе с материалами биопсии. С помощью цитолитических моноклональных антител проводят сортировку клеток для выделения нужной популяции (например, выделение стволовых кроветворных клеток для трансплантаций). Возможно создание моноклональных антител к антигенам вирусов, бактерий и других патогенов для лечения инфекционных заболеваний.

Области применения моноклональных антител:

с диагностической целью: определение экспрессии различных молекул;
блокада рецепторов;
инактивация и лизис клеток (лечение онкологических и аутоиммунных заболеваний).

Сначала были созданы гетероиммунные антитела (мышиные античеловеческие, овечьи антимышиные и т.д.). Их используют в основном для диагностических целей и селекции клеток. При введении в организм человека они вызывают выработку антител.

Препараты для клинического использования были созданы для обеспечения высокоспецифичного, высокоаффинного сродства моноклональных антител с антигеном в сочетании с минимизацией побочных эффектов, в частности выработки пациентом антител к чужеродному белку. Таким образом, антитело человека становится носителем антигенсвязывающего фрагмента мышиного иммуноглобулина. Эти препараты на 75% состоят из белка человека и на 25% — из белка мыши. Такая структура обеспечивает высокое сродство к антигену и уменьшает (хотя и не исключает) возможность образования против них антител организмом хозяина, что может вызвать серьезные побочные реакции, вплоть до развития анафилаксии. Пример химерного антитела — препарат ремикейд (инфликсимаб). Следующим шагом стало создание гуманизированных моноклональных антител, на 80-95% состоящих из белка человека и только на 5-10% — из белка мыши. Мышиного происхождения в этих молекулах — только гипервариабельные участки, формирующие антигенсвязывающий центр. Наконец, были созданы генно-инженерные, полностью гуманизированные моноклональные антитела, молекулы которых полностью состоят из белка человека. Большинство препаратов на основе моноклональных антител пациенты переносят хорошо. При использовании химерных возможна выработка антител к ним и развитие анафилактических реакций. Препараты, подавляющие функции и уменьшающие количество различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, могут вызвать снижение противоинфекционной резистентности и/или обострение хронических инфекций. Для предотвращения этих осложнений необходимо тщательное наблюдение за пациентами, получающими лечение препаратами на основе моноклональных антител, и своевременное назначение адекватной сопроводительной терапии. Те же меры предосторожности необходимо предпринимать для уменьшения риска и тяжести течения токсических реакций, описанных при применении моноклональных антител для лечения онкологических заболеваний (например, препаратов, подавляющих ангиогенез). При лечении антителами против ФНО-ot возможна активация скрытого туберкулеза. Перспективное направление в создании новых препаратов на основе моноклональных антител — каталитические антитела абзимы. Это молекулы, обладающие свойствами антител (могут связываться с определенными эпитопами) и биологических катализаторов различных химических реакций (энзимов).

Области применения абзимов:

Диагностика аутоиммунных заболеваний (анти-ДНК аутоантитела с каталитической активностью).
Лечение аутоиммунных заболеваний.
Лечение инфекционных заболеваний (создание абзимов, направленных на специфический катализ инфекционных агентов).

Заключение

В данной работе я раскрыла понятия моноклональных антител, гибридомной технологии, а так же историю и принципы получения моноклональных антител, гибридом, рассмотрела основных области применения МКАТ в иммунологии.

Развитие методов генной инженерии привело к появлению новых возможностей: вариабельные и константные участки генов, кодирующих антитела, можно комбинировать в пробирке, вносить в них мутации, отбирать необходимые варианты и экспрессировать в бактериях.

Перед современными учеными, исследующими моноклональные антитела, стоит множество актуальных задач. В частности, поиск решения проблемы иммуногенности препаратов, изготовленных на основе МАТ. Большинство препаратов на основе МАТ, которые сегодня проходят стадию клинических исследований, включают в состав человеческие антитела. Использование этого типа антител снизило иммуногенность препаратов, однако не устранило проблему полностью, поскольку иммунная система человека способна вырабатывать антитела против любого терапевтического белка.

Пока что длительность и высокая стоимость производства лекарственных средств с использованием моноклональных антител делает их не всегда доступными для пациентов. Однако ученые работают над созданием новых технологий, которые позволят выпускать новые препараты быстрее и по более низкой стоимости. Благодаря современным технологиям, уже сегодня многие препараты стали доступными для большого количества пациентов и позволили излечить заболевания, ранее считавшиеся неизлечимыми. Можно надеяться, что в будущем спектр излечимых заболеваний еще более расширится, а лекарственные средства на основе моноклональных антител станут еще более эффективными.