Клонирование организма

Основные сведения

Клонирование — появление естественным путем или получение нескольких генетически идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения. Термин «клонирование» в том же смысле нередко применяют и по отношению к клеткам многоклеточных организмов. Клонированием называют также получение нескольких идентичных копий наследственных молекул (молекулярное клонирование). Наконец, клонированием также часто называют биотехнологические методы, используемые для искусственного получения клонов организмов, клеток или молекул. Группа генетически идентичных организмов или клеток — клон.

Термин клонирование пришёл в русский язык из английского (clone, cloning).

Первоначально слово клон (англ. cloning от др.-греч. κλών — «веточка, побег, отпрыск») стали употреблять для группы растений (например, фруктовых деревьев), полученных от одного растения-производителя вегетативным (не семенным) способом. Эти растения-потомки в точности повторяли качества своего прародителя и служили основанием для выведения нового сорта (в случае полезности их свойств для садоводства). Позже клоном стали называть не только всю такую группу, но и каждое отдельное растение в ней (кроме первого), а получение таких потомков — клонированием.

Со временем значение термина расширилось и его стали употреблять при выращивании культур бактерий.

Успехи биологии показали, что и у растений, и у бактерий сходство потомков с организмом-производителем обусловливается генетической идентичностью всех членов клона. Тогда уже термин клонирование стали употреблять для обозначения производства любых линий организмов, идентичных данному и являющихся его потомками.

Позже название клонирование было перенесено и на саму технологию получения идентичных организмов, известную как замещение ядра, а потом также и на все организмы, полученные по такой технологии, от первых головастиков до овцы Долли.

И уже в конце 1990-х годов XX века, подразумевая возможность применения той же технологии для получения генетически идентичных человеческих индивидов, заговорили и о клонировании человека. Термин перестал быть достоянием научной общественности, его подхватили СМИ, киноискусство, литература, производители компьютерных игр, и он вошёл в язык как общеупотребительное слово, уже не имеющее того специального значения, которым он обладал около ста лет назад.

Природные и искусственные клоны

В природе всё-таки имеются случаи клонирования человека, это однояйцовые или монозиготные близнецы – настоящие клоны с одним и тем же геномом, возникающие при разделении одной зиготы на ранней стадии развития. Это всегда только оба мальчика или обе девочки и всегда удивительно похожие друг на друга. Известно также, что эмбрион млекопитающего, в том числе и человека на самых ранних стадиях развития, у человека, по крайней мере, до стадии 8 бластомеров, может быть без видимых отрицательных последствий разделён на отдельные бластомеры. Из них при определённых условиях могут развиться идентичные по своему генотипу особи, по аналогии с однояйцовыми близнецами, то есть из одного 8-клеточного эмбриона могут родиться 8 мальчиков или девочек абсолютно идентичных.

В природе широко распространено клонирование растений. Прежде всего, это относится к вегетативному размножению, что давно используется человеком. Дело в том, что у растений в отличие от животных по мере их роста, в ходе клеточной специализации – дифференцировки – клетки не теряют так называемые тотипотентные свойства, то есть, не теряют своей способности реализовывать всю генетическую информацию, заложенную в ядре. Поэтому практически любая растительная клетка, сохранившая в процессе дифференцировки своё ядро, может дать начало новому организму. Эта особенность растительных клеток лежит в основе многих методов генетики и селекции.

При вегетативном размножении и при клонировании гены не распределяются по потокам, как в случае полового размножения, а сохраняются в полном составе в течение многих поколений. Всё организмы, входящие в состав определённого клона имеют одинаковый набор генов и фенотипически не различаются между собой.

Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотентности, и в этом, одно из существенных отличий от клеток растений. Как будет показано ниже именно здесь главное препятствие для клонирования взрослых позвоночных животных.

История клонирования организмов

Клонирование растений черенками, почками или клубнями в сельском хозяйстве, в частности в садоводстве, известно уже более 4-х тыс. лет. Начиная с 70-х годов нашего столетия, для клонирования растений стали широко использовать небольшие группы, и даже отдельные соматические клетки. Гораздо большую сложность представляет клонирование животных. Первые шаги к клонированию животных были предприняты около ста лет назад зоологом Московского Университета Александром Тихомировым, открывшим на примере тутового шелкопряда партеногенез: развитие без оплодотворения в результате химических и физических воздействий. Однако партеногенетические эмбрионы шелкопряда были нежизнеспособны.

История клонирования позвоночных начинается в 40-е годы 20-го века, когда российский эмбриолог профессор, Г. Лопашов на лягушках разработал метод пересадки ядер, на котором основаны все современные эксперименты по клонированию. Метод состоит в выделении ядра соматической клетки и имплантации его в обезъядренную (энуклеированную) яйцеклетку.

Впервые возможность клонирования эмбрионов позвоночных была продемонстрирована американскими биологами на лягушках в начале 50-х годов. Затем в 1962 году зоолог Оксфордского университета Дж. Гердон существенно продвинул эти результаты, когда в опытах с южноафриканскими жабами стал использовать в качестве донора ядер не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника подросшего головастика. Выживало не более двух процентов клонированного потомства, да и у выживших наблюдались различные дефекты. Однако это был огромный шаг вперед по пути клонирования.

Перейти от амфибий к млекопитающим оказалось весьма трудно, главным образом по той причине, что размеры яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у земноводных. Но к концу 70-х эти трудности удалось преодолеть, так что к началу 80-х были освоены эксперименты по клонированию эмбрионов мышей, а к концу десятилетия ученые стали получать важные результаты на эмбрионах кроликов и крупных домашних животных. Вплоть до середины 90-х годов вопрос об использовании взрослых млекопитающих в качестве доноров ядер клеток практически не ставился, поскольку ученые-биологи занимались главным образом клонированием эмбрионов домашних животных, причем эксперименты в этой области и по сию пору проходят весьма непросто и с высоким уровнем неудач. Поэтому поистине сенсацией стала история с клонированием в 1996 году знаменитой ныне овечки Долли в шотландской фирме PPL Therapeutics (коммерческого отделения Розлин Института в Эдинбурге). Коллектив ученых, возглавляемый Иэном Уилмутом, продемонстрировал, что им удалось, используя соматические клетки взрослого животного, получить клональное животное – овцу по кличке Долли.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, значительное достижение в клонировании млекопитающих. Хотя она и не вызвала особого интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в 1997 году, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное – овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяла предыдущие исследования 1996 года, но в ней учёные использовали не только эмбриональные, но ещё и фибробластоподобные клетки (фибробласты – клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от 6-летней овцы породы Финн Дорсет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом – 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9 пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода на 4-6 пассажах и клетки молочной железы на 3-6 пассажах. Деление клеток всех трёх типов останавливали на стадии G0 и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые эмбрионы культивировали in vitro в химически определённой среде. Коэффициент выхода морул и бластул при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе (поэтому видимо, нет строгой необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro).

Относительный успех (Долли умерла от преждевременного старения) авторов этой работы, прежде всего, связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые вероятно и были использованы как доноры ядер. Большое значение имел также тот факт, что авторы, учитывая результат своих прошлых работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиента и яйцеклеток донора.

Предпринимаются и другие попытки клонирования с целью спасения исчезающих видов. Так, 11 коров с фермы в штате Айова уже вынашивают клоны младенцев бантенгов – исчезающую разновидность диких азиатских быков. Китайские ученые из Института зоологических исследований, намеренных клонировать исчезающих вид гигантских панд. Их индийские коллеги собираются аналогичным способом восстановить популяцию гепардов, окончательно истребленных охотниками в первой половине прошлого века, еще во времена правления Британской империи. Донорами яйцеклеток для клонированных животных станут гепарды из соседнего Ирана, принадлежащие к тому же виду, что и звери, прежде обитавшие на полуострове Индостан, а суррогатными матерями, в которых будут развиваться пересаженные яйцеклетки – самки индийского леопарда.

Клонирование растений значительно проще, чем клонирование животных. Мы рассмотрим только сравнительно новую технологию выращивания растений из изолированных групп клеток и отдельных соматических клеток.

Для клонирования достаточно растительную клетку изолировать из целого растения и поместить на питательную среду, содержащую солевые компоненты, витамины, гормоны и источник углеводов, она начинает делиться и образует культуру каллуса. В дальнейшем каллусы можно размножить и получить неограниченное количество биомассы. Основная трудность, с которой сразу же приходится сталкиваться исследователю – это то, что клетки в искусственных условиях начинают бурно делиться и расти, но при этом часто не в состоянии продуцировать вторичные метаболиты, т.е. биологически активные вещества растений.

Клонирование растений чаще применяется в комплексе с другими биотехнологическими методами, такими как слияние (гибридизация) клеток и трансгенез (межвидовой перенос генов). Целые растения из реконструированных клеток получают затем методом клонирования. Слияние клеток осуществляется несколькими способами с использованием так называемых фузогенных (т.е. сливающих) агентов различного происхождения: физического (переменное электрическое или магнитное поле), химического (катионы, полиэтиленгликоль и др.), биологического (вирусы). Растительные клетки перед слиянием превращают в протопласты (т.е. клетки, лишенные внешней жесткой клеточной стенки). Последующий отбор (скрининг) полученных гибридных клеток позволяет отобрать те из них, которые объединили геномы или фрагменты ДНК родительских клеток. Клеточная инженерия позволяет получать гибридные штаммы, клетки или даже целые растения (растения-регенераты), скрещивая между собой филогенетически (т.е. эволюционно) отдаленные организмы. В случае неполного слияния клеток (т.е. клетка-реципиент получает отдельные участки ядерного генетического материала или части клетки- донора (органеллы)) получаются асимметричные гибриды. Это расширяет возможности получения новых сортов сельскохозяйственных растений, для создания которых ранее использовались методы классической селекции.

Биологические и этические проблемы клонирования

Отдельным направлением клеточной инженерии, имеющим огромное практическое значение, является получение гибридом, т.е. клеток, возникающих при слиянии родительских клеток из одного организма, но с разными программами дифференциации и развития. Это могут быть клетки из разных типов ткани или опухолевые клетки. Наибольшее развитие гибридомная технология нашла в получении моноклональных антител (МкАТ). Методика была разработана Келлером и Мильштейном.

В этом случае гибридому получают между нормальной антителобразующей клеткой и опухолевой, плазмоцитомной клеткой. Плазмоцитома была взята потому, что она больше всего соответствовала АОК по типу дифференцировки. Весь ее синтетический аппарат был настроен на синтез иммуноглобулинов. Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые.

Для достижения этой цели авторы методики разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей среде. Прежде всего, был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которого можно было контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования. Известно, что имеются два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной – это путь новообразования нуклеотидов, звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот. Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем – способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот: гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего.

Для селекции гибридом надо было получить мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и, следовательно, погибающий в среде, содержащей Г, Т и А (ГАТ-среда). Такой мутант получили путем добавления в среду токсических аналогов Г и Т. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали. Выживали лишь те редкие мутанты, которые были неспособны усваивать Г и Т, то есть были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов. Теперь все было готово для получения гибридом, то есть гибридов нормальных АОК и плазмоцитомных клеток. Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом – белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК), и из них готовили взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в среду, содержащую Г, Т и А (ГАТ-среда). Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы. После недолгого (несколько дней) культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные клетки смертны и быстро погибают в культуре. Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь – от нормальной клетки. Такие гибриды, гибридомы, сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела.

Следующий этап после получения гибридом – клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0,2 см2. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток, которые культивировали в присутствии «кормящих» клеток, не имеющих отношения к гибридомам, но способствующих их росту. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Для этого использовали микрометоды выявления антител к соответствующему антигену. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно рассевали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела. Полученные клоны можно заморозить при – 700 С и хранить до того, пока они не потребуются. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам (так как гибридомы – это опухолевые клетки), где они будут расти, и накапливать колоссальные количества моноклональных антител. От одной мышки можно получить антител не меньше, чем от кролика. Эти антитела не содержат посторонних антител и настолько однородны физико-химически, что могут рассматриваться как чистые химические реактивы.

Далее гибридомы создают уникальные возможности в аналитических целях: их можно применять как «иммунологический микроскоп» с чрезвычайно высоким разрешением. Так, например, если нужно сравнить две клеточные линии, отличающиеся одним или немногими антигенами, и надо выявить такие антигены, то метод гибридом предоставляет для этого исключительные возможности. Проиммунизировав мышей одной из линий и получив сотни гибридом, продуцирующих антитела к антигенам этой линии, можно найти одну или две с антителами только к данной линии. Размножив такую гибридому в пробирке или вырастив ее на мышах, можно получить огромное количество антител к уникальному антигену (или детерминантной группе), затерянному среди других компонентов клетки подобно иголке в стоге сена. Это будет продукт одного клона. В крови иммунизированного животного среди множества других антител он никак не проявится из-за чисто количественных отношений. Благодаря гибридомам его можно не только обнаружить, но и вывести в линию и получить любое количество соответствующих антител. С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антитела и использовать их для диагностики и типирования опухолей. Такие моноклональные антитела нашли широкое применение в онкологической клинике. Наконец, во всем мире ведутся активные исследования по использованию моноклональных антител в качестве специфических переносчиков токсических веществ в опухолевые клетки. Пока же с помощью моноклональных антител в опухоль и ее метастазы доставляются радиоактивные вещества, позволяющие обнаружить небольшие узелки опухоли по локализации в них радиоактивности.

Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Они созданы на основе клонально-селекционной теории иммунитета и явились самым ярким и окончательным доказательством этой теории.

Гибридомы революционизировали иммунологическую промышленность и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей. И хотя гибридомы скорее относятся к изобретениям, а не к открытиям, они были отмечены в 1984 году Нобелевской премией, высшей научной наградой, присуждаемой за выдающиеся открытия. Особо следует отметить бескорыстность авторов. Если бы Кёлер и Мильштейн запатентовали свой метод, они вскоре бы стали миллиардерами, так как все, кто использовал бы гибридомы в коммерческих целях, должны были бы платить за право пользоваться патентом. Авторы гибридом, несомненно, понимали это, но в интересах развития науки не пошли на такой шаг. Метод гибридом беспрепятственно вошел во все сферы иммунологии, и сами авторы всемерно способствовали этому, предоставляя свою клеточную линию плазмоцитомы для исследований всем желающим. И первые гибридомы в нашей стране, полученные в 1979-1980 годах, были созданы на основе клеток, ведущих происхождение из лаборатории этих авторов и с их разрешения.

Наиболее удачными являются эксперименты по клонированию животных из эмбриональных недифференцированных клеток, не утративших тотипотентных свойств, однако есть положительные результаты и со зрелыми клетками. Процесс клонирования протекает следующим образом – ядро соматической клетки пересаживают в лишенную ядра (энуклеированную) яйцеклетку и имплантируют ее в организм матери (если это животное, требующее вынашивания).

Энуклеация традиционно проводится микрохирургически или путем разрушения ядра ультрафиолетом, пересадка производится с помощью тонкой стеклянной пипетки или электрослиянием. В последнее время ученые из датского Института сельскохозяйственных наук разработали недорогую технологию клонирования, которая гораздо проще используемой ныне. По новой технологии, яйцеклетки разрезаются пополам, и половинки с ядрами выбрасываются. Выбирается пара оставшихся пустых половинок, которые «склеиваются» в одну яйцеклетку после добавления нового ядра. Самая дорогая часть оборудования, которую использовали в этом эксперименте, — машина для «сварки» клеток — стоит всего лишь $3,5 тысячи. Технология может быть полностью автоматизирована и поставлена «на поток».

Успешность пересадки зависит от вида животного (амфибий клонируют успешнее, чем млекопитающих), методики пересадки и степени дифференцировки клетки-донора. Так, ещё Бриггс и Кинг в первых опытах на амфибиях установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию – гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в других работах.

Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.

У млекопитающих в качестве доноров используются малодифференцированные стволовые клетки или клетки ранних эмбрионов. Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургически удалять пронуклеусы из зигот (оплодотворенных яйцеклеток) млекопитающих и пересаживать в них клеточные. Опыты на мышах закончились полной неудачей – клоны гибли на стадии бластоцисты, что связано, очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша – уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно, поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Для кроликов (Стик и Робл, 1989) был получен результат – 3,7% реконструированных яйцеклеток развились до нормальных животных.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a in vivo – в перевязанном яйцеводе овцы – промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента — коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании.

Большие перспективы видят ученые в сочетании клонирования и трансгенеза. Трансгенез – это техника переноса экзогенной ДНК, то есть генов, через клетки зародыша в целый новый организм. Эксплуатируя этот метод, можно получать животных, несущих качественно новые признаки. Например, возможно создание пород, устойчивых к заболеваниям или несущих новые, полезные для промышленной деятельности человека признаки. С распространением трансгенеза процесс создания новых пород и линий продуктивных животных значительно ускорится. Кроме того, этот метод позволяет уже в настоящее время перенести исследования функциональной активности генов in vitro (на культурах клеток) в условия in vivo (на живых организмах), что важно для понимания фундаментальных основ жизни. По мнению многих видных ученых, технология создания трансгенных животных – это одна из наиболее захватывающих отраслей науки, появившихся в последние два десятилетия.

Производство человеческих рекомбинантных медицинских препаратов из молока трансгенных животных служит выходом из многих затруднений, связанных с микробными биореакторами, таких как отсутствие у бактерий посттрансляционных модификаций белков, неправильное складывание молекул синтезируемого вещества, высокие расходы на очищение. Использование клеточных культур животных в качестве биореакторов характеризуется высокими расходами на культуральные среды и невысоким выходом продукта. Поэтому многие специалисты в области клонирования видят главную задачу в применении технологии переноса ядер для создания и размножения трансгенных животных с полезными свойствами.

В настоящее время существуют разные технологии создания трансгенных животных. Наиболее распространенная – это микроинъекции генных конструкций в пронуклеусы зигот млекопитающих. Серьезным препятствием на пути использования этого метода является низкая эффективность его применения у сельскохозяйственных видов животных (<1%). Техника переноса ядер может помочь в решении и этой проблемы.

Создание трансгенных животных методом клонирования, как правило, начинается с получения культуры клеток-доноров ядер. В 1997 г. И. Уилмут, К. Кэмпбелл и др. выделили культуру овечьих фетальных фибробластов из плодов на 35-дневном сроке суягности. На втором этапе фибробласты трансфицировались экзогенной ДНК: двумя генными конструкциями, одна из которых несла ген 9-го фактора свертывания крови (ген интереса) под бета-глобулиновым промотором, вызывающим экспрессию в молочной железе овец, а другая – ген устойчивости к антибиотику неомицину (маркерный), который позволил отобрать трансфицированные клоны, а они в дальнейшем подвергались анализу на содержание нужного гена. Перенос ядер трансфектантов в энуклеированные ооциты происходил по методике, использованной при клонировании Долли. В итоге было получено три трансгенных ягненка, несущих оба гена: маркерный и ген интереса. Белок 9-й фактор свертывания крови играет важную роль в коагуляции крови, его недостаток вызывает гемофилию В.

В настоящее время он производится из человеческой сыворотки, поэтому выработка этого белка из молока овец могла бы стать альтернативным источником, лишенным потенциальной возможности переноса инфекционных заболеваний. Это было первое сообщение о рождении трансгенных животных в результате применения технологии клонирования. Уже известно о получении с использованием метода переноса ядер трансгенных мышей, крупного рогатого скота, овец и коз. В качестве доноров ядер использовались как трансфицированные культуры эмбриональных фибробластов, так и эмбриональных стволовых клеток.

Клонирование ценных трансгенных животных может быстро и экономично обеспечить человечество новыми лекарственными препаратами, содержащимися в молоке, специально полученных для этого генноинженерными методами овец, коз или коров. Появилось сообщение, что ученым из шотландской фирмы PPL Therapeutics, того самого, где была клонирована Долли, удалось получить успешные клоны овечек с измененной ДНК. Был внедрен ген, который добавляет в молоко овец фермент, используемый в современной фармакологии для лечения наследственной эмфиземы легких. При создании Долли половой процесс был «обойден», что позволило исключить случайно приобретаемые при скрещивании гены и открыть дорогу «чистому» генетическому программированию. Следующим шагом шотландских ученых стало выведение клонированных овец, которые имеют специальный ген, позволяющий им производить молоко с такими же белками, как у человека. По словам директора фирмы PPL Therapeutics Алана Колмена, «значение подобной методики заключается в том, что теперь мы можем выбирать еще до рождения гены, которые хотим изменить или удалить». А это уже означало принципиальную возможность выращивать для трансплантации человеческие ткани и органы внутри, к примеру, свиней, наиболее близких нам по ряду важных биологических параметров.

Несмотря на массовый ажиотаж по поводу достижений в области клонирования и многочисленные спекуляции в прессе и на телевидении в недавнем прошлом, принимая во внимание последние открытия в этой области, возникает больше вопросов, чем ответов на них. В настоящее время сама возможность получения стабильных клонов ставится под сомнение. Эпигенетическая модификация генома обеспечивает активацию определенных генов в разные периоды развития и включает метилирование ДНК, специфическое соединение гистонов в нуклеосомы и ремоделирование других хроматинассоциированных протеинов. Оба родительских генома формируются в течение гаметогенеза таким образом, чтобы соответствовать цитоплазматическому составу яйцеклетки и направлять развитие всего организма.

Чтобы успешно реализовать генетическую информацию, ядро соматической клетки после трансплантации должно быстро репрограммироваться для экспрессии генов, включаемых на ранних этапах развития. В 80-х годах Д. Солтер и другие исследователи установили, что отцовский и материнский геномы функционально неидентичны и оба необходимы для нормального развития. Такое явление называется геномным импринтингом (см. 1.3). Оно заключается в том, что из двух аллелей одного гена в гомологичных хромосомах после оплодотворения может быть функционально активным только отцовский или только материнский.

Нормальное развитие требует правильной экспрессии импринтированных генов. У клонированных животных из-за неполного репрограммирования ядра соматической клетки и нарушения экспрессии импринтированных генов возникает эпигенетическая нестабильность генома. Несоответствующий данному гену уровень метилирования изменяет его активность и может приводить к его полной инактивации или наоборот – к его активированию. Большинство процессов в организме находятся под двойным, тройным и т. д. контролем со стороны генетического аппарата клетки, благодаря этому в результате трансплантации ядер относительно часто рождается и вырастает полноценный молодняк. Исследователям не удалось идентифицировать гены, нарушение регуляции которых приводило бы к часто встречающейся патологии плаценты и аномальному весу у клонированных мышей. Возможно, что это результат кумулятивного воздействия многих неправильно экспрессирующихся генов. Выдвигается гипотеза, что развитие млекопитающих скорее толерантно к эпигенетической нестабильности и летальный эффект проявляется только при потерях нормальной регуляции во множественных локусах. Внешне здоровые клонированные животные могут иметь различные физиологические нарушения, которые трудно обнаружить.

До сих пор неизвестно, почему не удается размножить последовательным клонированием мышей далее 6-го поколения. Это может быть связано с накоплением в поколениях мутаций в соматических клетках или с укорочением в каждом раунде репликации концевых участков хромосом – теломер (см. 1.2). Процесс репликации ДНК при делении клеток происходит таким образом, что теломеры в течение жизни человека или животного укорачиваются. Существует фермент теломераза, который достраивает концевые участки хромосом, однако высокой теломеразной активностью обладают только тотипотентные клетки на ранних стадиях эмбрионального развития в период повышенного количества митозов и терминальные, которые дают начало гаметам.

Теломераза усиленно синтезируется также в опухолевых клетках, характеризующихся способностью к неограниченному делению. С укорочением концевых участков хромосом связывают в настоящее время процессы старения организма человека: когда теломеры достигают определенной длины, дальнейшее деление клеток становится невозможным, и ткани утрачивают свою регенерационную и функциональную активность. Так как при трансплантации ядер донором служат соматические клетки, не экспрессирующие теломеразу, для установления генетического возраста клонального животного определяется статус теломер в его клетках. Именно таким образом было показано, что первая клонированная из соматических клеток овца Долли генетически старше своих ровесников. Укорочение теломер у клонов в дальнейшем не подтвердилось в опытах на крупном рогатом скоте. Как оказалось, теломеразная активность заново возникает в клонированных эмбрионах и происходит восстановление концов хромосом до нормальной длины.

Клонирование млекопитающих это одна из захватывающих проблем современной биологии, однако, попытки создания клонов нельзя назвать успешными. Большая часть реконструированных зародышей не развивается далее ранних эмбриональных стадий, из родившихся около половины не достигают взрослого состояния, и нет уверенности в том, что взрослые клоны – абсолютно здоровые животные. Изучение фундаментальных основ генной экспрессии и генетического контроля развития поможет объяснить причины затруднений, с которыми сталкивается новое направление. Технология клонирования уже внесла огромный вклад в наше понимание ранних процессов развития, взаимодействия родительских геномов, репрограммирования ядер и геномного импринтинга. Было бы близорукостью отвергнуть метод трансплантации ядер, пока мы в точности не узнаем все возможные перспективы его использования.

Клонирование человека: этические проблемы

Принципиальная возможность клонирования человека вызвала бурное обсуждение во всем мире. С одной стороны появились горячие поклонники клонирования (вплоть до создания религиозных сект), видящие в нем возможность улучшения человеческой природы, достижения бессмертия или, по крайней мере, радикальный метод борьбы с болезнями. С другой стороны, еще более многочисленны голоса решительных противников всяких попыток клонирования человека. Традиционно консервативную позицию, занимают, в частности, представители ведущих религий.

Во многом, споры вокруг проблемы связаны с распространенной в обществе генетической безграмотностью. Опросы, проведенные в США, показали, что значительное число американцев боится создания «армий клонов», «выведения суперрасы». Есть люди, которые искренне считают, что с помощью клонирования можно в буквальном смысле возродить умерших людей и т.д. Но даже если оставить в стороне явные заблуждения, а также апелляции к религиозным чувствам, которые разделяют далеко не все, все равно остаются реальные этические проблемы. Репродуктивное клонирование вызывает следующие возражения: крайне низкая результативность клонирования, высокая летальность среди клонов делают попытки клонирования человека этически неприемлемыми, вплоть до усовершенствования методики до приемлемого уровня безопасности для клона.

Неизвестно, как будет влиять на развитие человека и структуру общества новый тип семейных отношений, который может сложиться в связи с распространением клонирования.

Предполагают, что клоны будут иметь проблемы со становлением личностного самосознания, с интеграцией в человеческое общество.

Клонирование ограничивает генетическое разнообразие человека

Терапевтическое клонирование вызывает вопросы в связи с технологией его проведения. В настоящее время реально осуществима только технология клонирования, предполагающая выращивание клона до определенного предела in vivo. Естественно, к человеку это не применимо – женщина не может рассматриваться как инкубатор терапевтического материала. Эта проблема решается разработкой оборудования для выращивания зародыша in vitro. Однако, остается проблема «убийства» зародыша. С каких пор зародыш становится человеком? Существует мнение, что новый человек возникает в момент зачатия (в случае клона – в момент пересадки ядра). В этом случае использование зародыша для выращивания трансплантатов недопустимо. На это возражают, что до определенного периода зародыш представляет лишь скопление клеток, но никак не человеческую личность. Для преодоления этой проблемы ученые пытаются начать работу с зародышем как можно раньше. Констатируем, что отношение общества к репродуктивному клонированию в целом отрицательное. Во всех странах, где уже разработано законодательство по клонированию, репродуктивное клонирование запрещено. Однако остается немало государств, не регулирующие вопросы клонирования, чем и пользуются научные авантюристы, пытающиеся (или делающие вид, что пытаются) клонировать человека.

К терапевтическому клонированию отношение более мягкое, что, видимо, вызвано его большей ценностью. Если трудно представить практическое применение репродуктивного клонирования (разве, что случаи бесплодия с невозможностью искусственного оплодотворения), то значение терапевтического клонирования, несомненно. Так, в Великобритании терапевтическое клонирование официально разрешено. При этом жестко ограничивается возраст эмбриона, с которым можно вести работу (в Британии – не более 10 недель).

Терапевтическое клонирование и его перспективы в медицине

Термин «терапевтическое клонирование» означает метод получения клеточных культур- трансплантатов, который заключается в том, что ядро соматической клетки пациента (например, кожных фибробластов) переносится в энуклеированный донорский ооцит. После процесса репрограммирования это ядро становится тотипотентным и инициирует формирование эмбриона, который на определенной стадии развития может использоваться для получения культуры эмбриональных стволовых клеток (ЭС клетки), обладающих ядерным геномом пациента. Культура ЭС клеток подвергается воздействию веществ- индукторов, вызывающих направленную дифференциацию в определенный тип клеток, например, в такие как кардиомиоциты для замещения поврежденного участка миокарда или в синтезирующие инсулин бета-клетки островков Лангерганса. В настоящее время разрабатываются другие методы получения ЭС клеточных культур с использованием технологии генетической модификации генома для отбора дифференцированных популяций.

Успешно проведенные эксперименты по клонированию макак-резус американскими учеными Л. Менг и др. из центра по изучению приматов в Орегоне свидетельствуют о потенциальной возможности переноса технологии трансплантации ядер на человека. Л. Менг и соавт. получили двух макак-резус в результате переноса ядер бластомеров из ранних эмбрионов. Ввиду значительного сходства физиологии и генетики у человека и остальных приматов для изучения процессов репрограммирования генома, развития клонов, как во время протекания беременности, так и в постнатальный период и их эпигенетической стабильности нечеловеческие приматы могут служить самой оптимальной моделью.

Прежде чем станет возможным всерьез воспринимать заявления о внедрении терапевтического клонирования в медицине необходимо добиться клонирования обезьян с использованием соматических дифференцированных клеток. Эффективность реконструкции эмбрионов приматов будет зависеть от оптимизации многих параметров. Наши представления о процессах созревания яйцеклеток в условиях in vitro все еще являются неполными, требуют усовершенствования протоколы слияния кариопласта с цитопластом и активации генома. Электрослияние не считается в настоящее время наиболее эффективным методом для соединения донорского ядра с энуклеированной яйцеклеткой: электрический импульс вызывает одновременно активацию реконструированного ооцита, вследствие чего в ядре не успевают завершиться процессы репрограммирования ядра. Уже разработаны методики по индукции слияния с использованием фитогемагглютинина, этиленгликоля и микрохирургическими методами, которые не вызывают одновременную активацию. Это позволяет отсрочить ее индукцию у прооперированного ооцита на 4-5 ч.

Даже внедряемая технология переноса незначительного количества цитоплазмы от ооцита здорового донора в реципиентную яйцеклетку пациента в настоящее время подвергается активной критике из-за возможной дисрегуляции во взаимоотношениях между ДНК ядра и митохондрий. Отрицательный эффект генетического химеризма может быть еще более сильным при тотальной замене цитоплазматического окружения кариопласта и проявиться в виде нарушений различной природы как во внутриутробный период развития, так и после рождения организма.

Новейшие технологии в области клонирования и создания эмбриональных стволовых клеток открывают огромные возможности для лечения многих заболеваний, связанных с дегенерацией определенных типов клеток, потерей функций тканей и целых органов. Около 16 млн. человек во всем мире страдают нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, свыше 120 млн. – диабетом и миллионы – артритами, СПИДом, инфарктами и другими заболеваниями, которые могут быть излечены с помощью применения клеточных трансплантатов.

По самым скромным подсчетам десятки наиболее распространенных заболеваний могут быть вылечены с внедрением клеточной терапии. Методы терапевтического клонирования позволяют избежать иммунного отторжения трансплантатов, поскольку ЭС клетки несут генетическую информацию донора ядер. Низкая эффективность трансплантации ядер не важна для осуществления клеточной терапии, так как для получения линии ЭС клеток достаточно всего одного или нескольких предимплантационных эмбрионов. Кроме того, сейчас рассматривается вопрос об использовании в качестве цитопластов энуклеированных яйцеклеток животных, например, крупного рогатого скота, которые поддерживают реализацию генетического материала ядра человеческой соматической клетки до стадии 5-дневного эмбриона.

Одной из перспективных сфер применения клонирования может оказаться ксенотрансплантация, то есть межвидовая трансплантация тканей и органов.

Некоторыми компаниями ведется работа по созданию линии свиней с инактивированным геном альфа-1,3-галактозилтрансферазы. Этот ген кодирует фермент, участвующий в синтезе поверхностных антигенов клеток свиней, которые обусловливают немедленное отторжение трансплантатов у приматов. Технология клонирования с использованием генетически модифицированных культур клеток в качестве доноров ядер значительно упростит процесс создания такой линии.

Важный результат получен американскими учеными, которым удалось разработать метод выращивания новых костей в позвоночнике крыс. В проведенных экспериментах ученые работали со стволовыми клетками. Они модифицировали их так, что стволовые клетки костного мозга стали экспрессировать белок ВМР-9, который способствует росту новых костей. Затем модифицированные клетки были инъецированы в одну сторону позвоночника крыс, в то время как в другую ученые инъецировали стволовые клетки, содержащие инактивированный ген. Через 8 недель после начала эксперимента был зафиксирован рост костей лишь на той стороне спины, которая содержала модифицированные стволовые клетки. При этом вновь образованные кости выглядели абсолютно нормально. Эта методика пока не была опробована на людях, однако исследователи полагают, что этот метод генной терапии, который включает в себя этап работы с клетками вне организма, является многообещающим для лечения заболеваний костей, а также показателем перспективности терапевтического клонирования вообще.

Не менее интересные результаты получили российские ученые. Им удалось клонировать из стволовых клеток человека кардиомиоциты.

Гематологическое клонирование. На определённой стадии развития эмбрион состоит из абсолютно одинаковых стволовых клеток. Позже они станут дифференцированными и будут отвечать за развитие разных органов. После рождения стволовые клетки продолжают оставаться в организме, обеспечивая обновление стареющих клеток, но с возрастом они по тем или иным причинам кончаются или погибают. Клетки перестают обновляться, что крайне пагубно влияет на здоровье человека и предположительно является причиной старения организма. Если бы стволовые клетки не погибали, возможно (это следует подчеркнуть) организм не был бы подвержен старению вообще или этот процесс проходил бы не так быстро. Гематологическое клонирование направлено на восполнение потерянных стволовых клеток, наличие которых должно оттянуть смерть пациента на как можно более долгий срок. Также оно может быть использовано для восстановления поврежденных органов.

Сам процесс выглядит следующим образом: из любой клетки пациента извлекается ядро, которое затем помещается в яйцеклетку. Начинается развитие. По истечении четырёх суток зародыш представляет крошечный пузырёк (бластоциста) заполненный стволовыми плюрипотентными (недифференцированными) клетками. Когда, по мере развития стволовые клетки стали мультипотентными (дифференцированными) и их количество достаточно велико, их можно извлечь и ввести пациенту. Самое трудное, что нужно сделать – это подтолкнуть плюрипотентные клетки к развитию в нужном направлении.

Важные результаты в этой области были получены в США. Согласно предварительным результатам, американские учёные находятся на заключительном этапе разработки технологии, которая позволит восстанавливать поврежденные возрастом или болезнью органы с помощью клонированных клеток этого же организма.

В случае если новая методика зарекомендует себя как эффективная и безопасная, ее можно будет использовать для заместительной терапии больных лейкемией, а также автоиммунными заболеваниями, в частности, артритом. Кроме того, отмечается, что клонированные стволовые клетки крови могут способствовать восстановлению широкого круга других органов. Вероятно, такие регенеративные свойства связаны с тем, что «омоложенные» кровяные клетки более интенсивно уничтожают старые и дефектные клетки и структуры органов, тем самым, способствуя их обновлению.

Однако до того как описанная методика сможет быть применена в клинике, следует провести ещё большой объем исследований. В частности, сейчас необходимо выяснить, не могут ли клонированные клетки приобретать злокачественные свойства. Следует также отметить, что в случае с коровами, использовавшимися в опытах массачусетскими исследователями, стволовые клетки извлекались из 100-дневных эмбрионов, что ни в коем случае не допустимо в отношении человека. Сейчас учёные решают вопрос получения стволовых клеток на максимально ранних этапах развития зародыша.