Приготовить рабочее разведение исследуемой сыворотки 1:5 : в стерильную пробирку градуированной пипеткой внести 1 мл исследуемой сыворотки и 4 мл стерильного физиологического раствора, перемешать пипетированием

В 6 лунок внести физиологический раствор 1 мл и отдельно в 2 лунки для контролей

Градуированной пипеткой набрать 1 мл из разведения 1:5 и внести в 1-ую лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:10

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 1-ой лунки и внести во 2-ую лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:20.

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 2-ой лунки и внести во 3-ю лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:40.

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 3-ей лунки и внести во 4-ю лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:80.

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 4-ой лунки и внести во 5-ю лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:160.

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 5-ой лунки и внести во 6-ую лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:320.

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл рабочего разведения сыворотки 1:5 внести в 1-ую контрольную лунку перемешать пипетированием

Взять новую градуированную пипетку, внести в каждую лунку по 0,5 мл взвеси эритроцитарного антительного HBs-диагностикума, кроме контрольных.

Взять новую градуированную пипетку, набрать 0,5 мл взвеси  эритроцитарного антительного HBs-диагностикума внести в 2-ую контрольную лунку перемешать пипетированием с физиологическим раствором

Инкубирование в термостате при 37˚С 60 мин.

Учет результатов: при положительной реакции на дне лунок образуется мелкозернистый осадок по всей поверхности в виде «зонтика». При отрицательном результате осадок с ровными краями, в виде «пуговки»

на приготовленный и окрашенный мазок на предметном стекле нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;

повернуть револьвер до отметки иммерсионного объектива Х100;

осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла;

установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;

провести окончательную фокусировку препарата микроскопическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота.

Внести в штатив в один ряд 5 стерильных серологических пробирок и отдельно еще 2 пробирки для контроля реакции. Пронумеровать пробирки 1-5, контрольная №1 – КС (контроль сыворотки), контрольная №2 – КАг (контрольная антигена).

Внести во все пробирки, кроме контроль №1 – КС, 0,5 мл стерильного физиологического раствора.

Из сыворотки больного готовят рабочее разведение сыворотки – 1:25. Для этого в пробирку вносят 24 мл физиологического раствора + 1 мл сыворотки больного.

В 1-ую пробирку добавляют к 0,5 мл физиологического раствора 0,5 мл рабочего разведения сыворотки (1:25), тщательно перемешивают пипетированием. Подписывают разведение 1:50.

Новой пипеткой из 1-ой пробирки раствор переносят во 2-ую пробирку тщательно перемешивают пипетированием. Подписывают разведение 1:100.

Новой пипеткой из 2-ой пробирки раствор переносят в 3-ю пробирку тщательно перемешивают пипетированием. Подписывают разведение 1:200.

Новой пипеткой из 3-й пробирки раствор переносят в 4-ю пробирку тщательно перемешивают пипетированием. Подписывают разведение 1:400.

Новой пипеткой из 4-ой пробирки раствор переносят в 5-ю пробирку тщательно перемешивают пипетированием. Снова набирают 0,5 мл из 5-й пробирки и выливают в дезинфицирующий раствор Подписывают разведение 1:800.

Ампулу с диагностическим антигеном вскрывают, во все пробирки, кроме контроль №1 – КС (контроль сыворотки) вносят по 3 капли диагностического бруцеллезного антигена.

Перемешать  встряхивая штатив

Инкубация в термостате при температуре 37˚С 2 часа

Учет результатов реакции агглютинации: при положительной реакции на дне пробирки проявляется осадок (комплексы антиген+антитело), при отрицательном результате во всех пробирках жидкость прозрачная. Все контроли должны быть отрицательными. Титр антител – последнее разведение в ряду пробирок, дающее положительный результат.

Подготовить ингредиенты реакции: антиген 1 – неспецифический антиген (липиды из мышцы сердца быка), 2 и 3 – специфические антигены трепонемы, инактивированная исследуемая сыворотка, изотонический раствор хлорида натрия, комплемент в рабочей дозе, гемолитическая система и пронумеровать 4 пробирок (1-я, 2-я, 3-я, 4-я (контроль)).

Внесение исследуемой сыворотки во все пробирки по 0,1 мл.

Внесение изотонического раствора натрия хлорида по 0,4  мл в 1-, 2- и 3-ю пробирки и по 0,9 мл в 4-ю пробирку.

Внесение 0,5 мл неспецифического антигена 1 в 1-ю  пробирку

Внесение 0,5 мл специфического антигена 2 во 2-ю пробирку

Внесение 0,5 мл специфического антигена 3 во 3-ю пробирку

Внесение комплемента по 0,5 мл во все пробирки, гомогенизировать.

Инкубация в термостате при 37⁰С в течение 45 мин.

Добавление гемолитической системы по 1,0 мл во все пробирки. Встряхивают и выдерживают 40-60 мин при 37⁰С в термостате

Учет результатов. В первых трех пробирках «положительная реакция» +++ – полная задержка гемолиза (жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно. «отрицательная реакция» «-» – гемолиз (полный лизис эритроцитов, жидкость окрашена (лаковая кровь)).

На поверхности обезжиренного стекла карандашом нарисовать кружок диметром 15-20 мм

В центр кружочка вносят материал больного петлей круговыми движениями.Бактериологическую петлю простерилизовать, поставить в штатив.

Мазок подсушивают над пламенем горелкив теплой струе воздуха до полного высыхания

На подсушенный мазок вносят 2-3 капли диагностической сыворотки против хламидий

Инкубация в влажной камере в термостате при 37˚С 30 мин

Промывают препарат промывочным раствором

На мазок вносят 2-3 капли антивидовой флюоресцирующей сыворотки

Инкубация в термостате при 37˚С 30 мин

Промывают препарат промывочным раствором

Вносят 1 каплю иммерсионного масла, микроскопируют.

Учет результатов: при положительном результате в мазке будет обнаруживаться зеленовато желтое свечение на темном фоне. При отрицательной реакции все поля зрения при микроскопии будут темными без свечения.

В три лунки микропланшета внести исследуемую сыворотку

В следующий ряд в три лунки внести сыворотку с антителами к ВИЧ (положительный контроль)

В следующий ряд в три лунки внести сыворотку без антител к ВИЧ (отрицательный контроль)

Инкубация в термостате при 37ºС в течение 1 часа

Промыть все лунки промывочным раствором 5 раз

Внести во все лунки антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом пероксидазой (конъюгат)

Инкубация в термостате при 37ºС в течение 1 часа

Промыть все лунки промывочным раствором 5 раз

Внести во все лунки субстрат для фермента пероксидазы – хромоген

Инкубация в термостате при 37ºС в течение 30минут

Внести во все лунки стоп реагент

Анализ оптической плотности раствора в микропланшетев считывающих аппаратах – риддеры. При положительной реакции раствор в лунках окрашивается в желтый цвет, при отрицательной реакции – бесцветная. Окончательные результаты выдает риддер – цифровые показатели оптической плотности раствора в лунках

обработать кожу тампоном, смоченным 70%-м этиловым спиртом, затем другим тампоном, смоченным 1-2%-м раствором йода или другим дезинфектантом, разрешенным к применению для этих целей в установленном порядке, круговыми движениями, начиная от центра, в течение 30 с. (средняя треть предплечья);

Шаг 2

Положите шарик в лоток для использованного материала.

Возьмите стерильный сухой ватный шарик. Положите его под 5 палец левой руки.

Возьмите шприц в правую руку срезом иглы и шкалой вверх.

Захватите кистью левой руки предплечье ребенка, и пальцами натяните кожу снизу.

Введите в кожу только срез иглы, держа шприц почти параллельно коже.

Зафиксируйте первым пальцем левой руки муфту иглы, прижав ее к коже.

Перенесите на поршень правую руку и, надавливая на поршень введите туберкулин. Внимание! в месте инъекции должен образоваться беловатый бугорок в виде «лимонной корочки» 4-5 мм в диаметре.

Извлеките иглу, не прижимая место инъекции сухим шариком

Пригласить пациента через 48 – 72 ч. Для учета результатов.

На поверхности обезжиренного стекла карандашом на расстоянии друг от друга нарисовать 3 кружочка

В 1-ый и 2-ой кружок внести по 1 капле диагностической агглютинирующей сыворотки стерильной пипеткой. В 3-ий кружок внести 1 каплю физиологического раствора

Бактериологическую петлю простерилизовать над пламенем горелки, остудить, взять с поверхности агара культуру, внести в 1-ую каплю, размешать круговыми движениями.

Бактериологическую петлю простерилизовать над пламенем горелки, остудить, взять с поверхности агара культуру, внести в 3-ю каплю с физиологическим, размешать круговыми движениями.

Бактериологическую петлю простерилизовать, поставить в штатив.

Инкубация при комнатной температуре 2-5 мин. Учет результатов. При положительном результате в 1-ой капле будет видны хлопья агглютината, вторая капля (отрицательный контроль) прозрачная, 3 3-ей капле (контроль антигена) равномерная муть.

Взять стерильную пробирку со средой накопления и стерильной ректальной петлей.

Больного уложить на кушетку на правый бок, ноги подтянуты к животу (согнуты в коленях).

Ректальную петлю вынуть из пробирки и ввести в прямую кишку вглубь на 5-8 см.

Ректальную петлю осторожно вынуть из прямой кишки и опустить в пробирку со средой обогащения.

Подписать пробирку: указать Ф.И.О., возраст, домашний адрес обследуемого, диагноз

Подготовить стерильную баночку с лопаточкой для забора испражнений.

Непосредственно перед заборами материала (кала, испражнений) открыть баночку.

Забор испражнений (не менее 1,0 грамма) производят из нескольких мест лопаточкой, которая находится в баночке.

Лопаточку с фекалиями опускают в баночку, закрывают крышкой

Подписать баночку: указать Ф.И.О., возраст, домашний адрес обследуемого, диагноз

Кожу вокруг раны предварительно обрабатывают спиртом (70%) или другим антисептиком.

Некротические массы, детрит, гной удаляют стерильной салфеткой.

Взятие материала (раневого отделяемого) проводится круговыми движениями стерильным тампоном от центра к периферии раны.

Раневое отделяемое на тампоне асептически переносится в пробирку с транспортной средой.

Подписать пробирку: указать Ф.И.О., возраст, домашний адрес обследуемого, диагноз

провести предварительный туалет наружных половых органов

Попросить обследуемого выпустить небольшое количество мочи в мочеприемник или другую емкость

Затем произвести забор средней порции свободно выпущенной мочи, в количестве 3-5 мл в стерильную посуду (полимерную банку) с плотно прикручивающейся крышкой

Подписать баночку: указать Ф.И.О., возраст, домашний адрес обследуемого, диагноз

обработать кожу тампоном, смоченным 70%-м этиловым спиртом, затем другим тампоном, смоченным 1-2%-м раствором йода или другим дезинфектантом, разрешенным к применению для этих целей в установленном порядке, круговыми движениями, начиная от центра, в течение 30 с.;

Шаг 2

Стерильным шприцем произвести венепункцию

Произвести забор крови (5 мл) в шприц

над пламенем спиртовки открыть флакон с двухфазной средой

внести кровь во флакон из шприца, предварительно сняв иглу

обжечь горлышко и пробку флакона в пламени спиртовки, закрыть флакон пробкой

осторожно, чтобы не замочить пробку флакона, перемешать его содержимое круговыми движениями.

Взять три чашки Петри с питательной средой, промаркировать 1,2,3.

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки.

Стерильной бактериальной петлей взять каплю исследуемого материала.

В первую чашку Петри вносят каплю материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды.

Не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во 2-ю чашку Петри и втирают в поверхность питательной среды.

Не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят в 3-ю чашку Петри и втирают в поверхность питательной среды.

Инкубация в термостате при 37⁰С в течение 18-24 часов.

Результат. Большее количество колоний вырастает в 1-2-й чашках, изолированные колонии – в 3-ей чашке.

Взять три пробирки с 15 мл расплавленным мясо-пептонным агаром, 3 стерильные чашки Петри, промаркировать 1,2,3.

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки.

Стерильной бактериальной петлей взять каплю исследуемого материала.

В первую пробирку вносят каплю материала и вращают несколько раз, зажав между ладонями.

Прокаленной и остуженной бактериальной петлей содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю пробирку, гомогенизируют вращательными движениями.

Прокаленной и остуженной бактериальной петлей содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю пробирку, гомогенизируют вращательными движениями.

Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в пронумерованные стерильные чашки Петри, соответствующим номерам пробирок.

Инкубация в термостате при 37⁰С в течение 18-24 часов.

Результат. Большее количество колоний вырастает в 1-2-й чашках, изолированные колонии – в 3-ей чашке.

Первый день: Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки, остудить, внести в пробирку с исследуемым материалом, прикоснутся кончиком петли к материалу

левой рукой приоткрывают один край чашки, вводят петлю внутрь

у противоположного края делают петлей несколько штрихов в одном месте

петлю отрывают и засевают материал параллельными штрихами от одного края чашки к другому с интервалом 5-6 мм.

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки и поставить в штатив. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 часов.

Второй день: Изучение культуральных признаков: описать выросшие колонии

Изучение морфологических признаков: Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки, остудить и из ½ колонии приготовить фиксированный мазок, окрасить по Граму, микроскопировать, определить форму микроорганизма и расположение бактерий, тинкториальные признаки.

Выделение чистой культуры – Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки, остудить, оставшуюся ½ колонии пересеять на скошенный агар.

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки и поставить в штатив

Посевы инкубируют в термостате при 37С 18 – 24ч.

Третий день: Изучение чистоты, выделенной на скошенном агаре культуры: приготовить фиксированный мазок, окрасить по Граму, микроскопировать, определить форму и расположение микроорганизмов,

тинкториальные свойства.

Изучение биохимических признаков: выбрать тесты для идентификации, произвести постановку этих тестов.

Постановка теста на чувствительность выделенной культуры

к антибиотикам

Четвертый день: Идентификация выделенной культуры: учет результатов тестов.

Учет результатов определения чувствительности выделенной культуры

к антибиотикам

Заполнение и выдача результата бактериологического исследования и антибиотикограммы.

Пробирку со средой Китта-Тароцци прогреть на кипящей водяной бане в течение 10-20 мин, охладить до 30-37⁰С.

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки.

Стерильной бактериальной петлей взять каплю исследуемого материала.

Засевают в пробирку со средой Китта-Тароцци.

Инкубация в анаэробных условиях: в СО₂ инкубаторе, в эксикаторе или анаэростате при температуре 37⁰С на 24-48 часов.

Второй день. Просматривают посевы, при помутнении среды с придонным ростом бактерий и газообразовании приготовить мазки.

Мазки окрасить по Граму, микроскопия

Результат микроскопии. Под микроскопом в мазках видны крупные споровые грамположительные палочки

Пересев материала с Китта-Тароцци на кровяной сахарный агар и в столбик сахарного питательного агара в пробирке, железосульфитный агар (среда Вильсон-Блера).

Посевы инкубируют в анаэробных условиях: в СО₂ инкубаторе, в эксикаторе или анаэростате при 37⁰С в течение 48-72 часов.

Просмотр выросших колоний на кровяном сахарном агаре, высоком столбике сахарного агара в пробирке и Вильсон-Блера среде после инкубации.

Пересев типичных колоний на среду Китта-Тароцци или тиогликолевую среду (получение чистой культуры).

Инкубация в строго анаэробных условиях в термостате при 37⁰С в течение 24-48 часов.

После инкубации идентификация чистой культуры по биохимическим признакам традиционными методами или с помощью тест-систем для определения специфических бактериальных ферментов или метаболитов.

Определение продукции факторов вирулентности: серологическая идентификация экзотоксинов в реакции нейтрализации

Определение чувствительности к антибиотикам в строго анаэробных условиях.

Окончательный результат.

На нефиксированный мазок наносят 0,5 % р-р HCI и подогревают над племенем горелки в течение 1-2 мин, после чего остатки кислоты сливают

Шаг 2

Промывают водой, подсушивают и фиксируют над пламенем горелки.

Препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят карболовый фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще paз.

После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.

Препарат обесцвечивают 5% р-ром серной кислоты, наливая кислоту на стекло.

Препарат несколько раз промывают водой.

Окрашивают водно-спиртовом раствором метиленового-синего в течение 3-5мин.

Препарат промывают водой и высушивают, промокая фильтровальной бумагой.

Нанести на мазок 1 каплю иммерсионного масла.

Результат: Споры принимают ярко-красный цвет фуксина. Вегетативное тело бактерии, обесцвеченной серной кислотой, окрашивается дополнительной краской в синий цвет.

Градуированной пипеткой внести на поверхность питательной среды взвесь микроорганизмов в объеме 0,5 мл. Использованную пипетку поместить в дезинфицирующий раствор

Стерильным бактериологическим шпателем распределить по поверхности агара. Использованный шпатель поместить в дезинфицирующий раствор

Приоткрытые чашки подсушить в течение 10 мин.

Стерильным пинцетом внести диски с антибиотиками, не более 6 дисков на чашку диаметром 100 мм. Расстояние между дисками 20 мм

Инкубация в термостате при 37ºС в течение 18-24 часа

Учет результатов. При положительном результате вокруг диска с антибиотиком будет зона задержки роста микроорганизмов. При отрицательном результате вокруг дисков зона задержки роста микроорганизмов не будет

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки.

Бактериальной петлей разделить среду на две половинки по середине кровяного сахарного агара

Стерильной бактериальной петлей взять культуру анаэробов из среды Китта-Тароцци или каплю исследуемого материала и засевают одну половину агара.

Простерилизовать бактериальную петлю, взять культуру аэробов, например кишечной палочкой (Escherichia coli) и засеять другую половину питательного агара.

Засеянные чашки Петри закрывают, инкубируют в анаэробных условиях: в СО₂ инкубаторе, в эксикаторе или анаэростате при температуре 37⁰С на 24-48 часов.

Второй день. Просматривают посевы, выделяют подозрительные колонии в зоне роста анаэробных бактерий.

Мазки окрасить по Граму, промикроскопировать

Результат. Под микроскопом в мазках видны крупные споровые грамположительные палочки

Взять обезжиренное предметное стекло. Ограничить зону мазка, нарисовав стеклографом кружок

Шаг 2

Стерильной пастеровской пипеткой нанести 1 каплю стерильного физиологического раствора на предметное стекло

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки

Остуженной стерильной бактериальной петлей произвести отбор исследуемой колонии

Внести отобранную колонию в физ.раствор, хорошо перемешать

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки и поставить в штатив

Подсушить препарат в потоке теплого воздуха над пламенем горелки.

Нанести на мазок 1 каплю иммерсионного масла.

На поверхности обезжиренного стекла карандашом нарисовать кружочек

В кружок пипеткой внести 1 каплю физиологического раствора

Бактериологическую петлю простерилизовать над пламенем горелки, остудить, взять с поверхности агара культуру, внести в каплю физиологического раствора, размешать круговыми движениями.

Бактериологическую петлю простерилизовать, поставить в штатив.

Пинцетом взять предметное стекло и просушить в теплой струе воздуха высоко над пламенем горелки.

Препарат зафиксировать, опуская в пламя горелки на 1 сек. 3 раза

Нанести на мазок 1 каплю иммерсионного масла, микроскопировать

На мазок, фиксированный над пламенем горелки, кладут фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом и наносят несколько капель воды. Прокрашивание 1-2 минуты.

Снимают бумагу, сливают остаток красителя и, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1-2 мин до почернения препарата.

Раствор Люголя сливают. Для обесцвечивания на мазок капают несколько капель этилового спирта,  30 секунд -1 мин.

Препарат тщательно промывают водопроводной водой.

Препарат докрашивают водно-спиртовым раствором фуксина в течение 2 минут.

Препарат тщательно промывают водопроводной водой, промокая фильтровальной бумагой.

Микроскопия. На высушенный окрашенный мазок-препарат наносят каплю иммерсионного масла и смотрят под увеличением объектива 90-100.

Результаты окраски. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии – в ярко-малиновый цвет.

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю туши

Простерилизовать бактериальную петлю

Стерильной бактериальной петлей произвести отбор исследуемой колонии

Внести отобранную колонию в каплю туши, гомогенизировать

Препарат высушивают на воздухе и фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова.

Промывают водой

Окрашивают карболовым фуксином Циля, 3-5 мин

Промывают водой, высушивают при комнатной температуре

Микроскопия с иммерсионной системой

Результаты окраски. Фон  препарата темный, микробные тела окрашиваются в красный цвет, а окруженная ее капсула не окрашиваются тушью, остаются бесцветными

На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в пламени до появления паров.

Препарат промывают дистиллированной водой, бумагу сбрасывают пинцетом в ванночку для отходов.

Вносят пипеткой несколько капель на поверхность мазка 5% раствора серной кислоты на 2-4 сек.

Промывают дистиллированной водой

Вносят пипеткой несколько капель синьки Леффлера. Время окраски 3-5 минут

Промывают дистиллированной водой, высушивают фильтровальной бумагой.

Нанести 1 каплю иммерсионного масла, микроскопировть. Учет результатов: на голубом фоне будут видны палочковидной формы бактерии красного цвета