Тізбекті полимеразды реакция

Тізбекті полимеразды реакция

Тізбекті полимеразды реакцияны 1983 жылы Кэри Маллисом ашқан. Оның мақсаты ДНҚ ферментті полимеразаның көмегімен ДНҚ-ны амплицирлеу және ДНҚ-ң алғашқы молекуласының барысымен көптеп екі еселенуі.

Тізбекті полимеразды реакция (полимераза цепная реакция)– бұл молекулалық биологияның  экспериментальді әдісі, биологиялық материалда (сынамада) нуклеин қышқылының (ДНҚ, РНҚ) белгілі фрагменттерінің аз концентрациясын көбірек игеру.

Негізгі қолдану көрсеткіштері:

• Инфекциялық аурулардың диагностикасы- ГЕПАТИТТІҢ БАРЛЫҚ ТҮРЛЕРІНЕ ТЕКСЕРІЛЕСІЗ.
• Онкологиялық аурулардың диагностикасы (лейкемиялар және лимфомалар, сүт безі рагі т.б. қатерлі жаңатүзілістер);
• Генетикалық аурулар диагностикасы;
• Жеке идентификация (сот медицинасы және криминалистика, мүшелер мен тіндер трансплантациясы, генетикалық тест арқылы әкелікті анықтау );
• Тағам патогенділігінің диагностикасы .

ТПР САТЫЛАРЫНЫҢ ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ:

• ТПР 3 негізгі  сатыдан тұрады, 20-40 рет қайталанып отырады. Бұл цикл термоциклді аппаратта жүреді, ол оте аз уақыт ішінде қоспалық реакцияның температурасын жоғарылатады немесе төмендетеді.
• Денатурация – 94°C жуық:
• Денатурация кезінде ДНК-ң 2 тізбегі балқиды да бір тізбекті болып  түзіледі. (барлық энзимді реакциялар тоқтайды).
• Аннеалинг (күйдіру) – 54°C жуық:
• Сутектік байланысы біртіндеп құралады және  бір тізбекті ДНК мен жалғыз праймерлер арасы бұзылады. Егер праймер ДНҚ-ң комплементарлы аймағында орналасса, праймер матрицада қалып қояды себебі сутектік байланыс өте күшті.
• Ұзаруы  (элонгация) – 72°C жуық

• Әрбір цикл ДНК жібінің санын екі еселендіреді.
• Бірнеше біріншілік циклдан кейін өнімнің көпшілігі ДНҚ кесіндісіне ұсынылады, олардың ұзындықтары праймерлер арасындағы негізгі көлеммен сәйкес келеді.
• Нәтижесінде ДНҚ кесіндісінде праймерлер арасындағы түзілістердің  көлемі кенеттен жоғарылайды. 20 циклдан кейін синтезделген ТПР  өнімінің санының көлемі  1 млн. дейін жетеді. 40 циклдан кейін –  1 x 1012

ТПР-дың қасиеті:

• Арнайылығы
• Жүргізілуі
• Сезімталдығы
• Сенімділігі

ТПР ерекшеліктері:

• Nested PCR (ұяшықты – праймерлермен салынған ТПР
• RT-PCR – пцр , матрицаның орнына РНК қолданылуы, реакцияның кері транскрипциямен жүруі
• Real time PCR – ТПР шынайы уақыт тәртібінде зерттеудің жасалынуы

 Тізбекті полимеразды реакцияның  өнімінің  дұрыс шығуына шығуы және арнайылығын жақсартатын өнімдер: 

• Tа ДНК-ға және праймерлерге – формамид, диметилсульфоксид (ДМСО), сперимидиндерге әсер етушілер
• ДНК (белок SSB, белок 34 фагтарға Т4) конформациясына әсер етушілер
• Полимераза қасиетіне әсер етушілер (бетаин, желатин, глицерин)

Амплификация бағдарламасы қалай құралады:

1. Реакциялық қоспаны біріншілік қыздыру – 90-95 ⁰С – 1-5 мин
2. ДНҚ денатурациясы- 90-95 ⁰С – 5-10 сек.
3. Праймерлерді күйдіру– 50-55 ⁰С – 10-15 сек
4. Элонгация (праймерлерді алып тастау) –68-72 ⁰С
5. Циклдер саны – 38-40
6. Соңғы элонгация (соңғы құралуы) –72 ⁰С – 5-10 мин
7. ТПР өнімдерін сақтау – 4-10 ⁰С

• 1) 95^оС – 7мин
• 2) 95^оС – 10сек
• 3) 50-57 ^оС  – 15сек
• 4) 72^о C – 30ceк
• 5) 72^о C – 5мин
• 6) 10^о C – +∞