Люминесценция — излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела при данной температуре и имеющее длительность, значительно превышающую период световых волн. Первая часть этого определения предложена Э. Видоманом и отделяет люминесценцию от равновесного теплового излучения. Вторая часть — признак длительности — введена С. И. Вавиловым для того, чтобы отделить люминесценцию от других явлений вторичного свечения — отражения и рассеяния светла, а также от вынужденного испускания, тормозного излучения заряженных частиц.
Для возникновения люминесценции требуется, следовательно, какой-либо источник энергии, отличный от равновесной внутренней энергии данного тела, соответствующий его температуре. Для поддержания стационарной люминесценции этот источник должен быть внешним. Нестационарная люминесценция может происходить во время перехода тела в равновесное состояние после предварительного возбуждения (затухание люминесценции). Как следует из самого определения, понятие люминесценции относится не к отдельным излучающим атомам или молекулам, а и к их совокупностям – телам. Элементарные акты возбуждения молекул и испускания света могут быть одинаковыми в случае теплового излучения и люминесценции. Различие состоит лишь в относительном числе тех или иных энергетических переходов. Из определения люминесценции следует, также, что это понятие применимо только к телам имеющим определенную температуру. В случае сильного отклонения от теплового равновесия говорить о температурном равновесии или люминесценции не имеет смысла.
Признак длительности имеет большое практическое значение и дает возможность отличить люминесценцию от других неравновесных процессов. В частности он сыграл важную роль в истории открытия явления Вавилова-Черенкова, позволив установить, что наблюдавшееся свечения нельзя отнести к люминесценции. Вопрос о теоретическом обосновании критерия Вавилова рассматривался Б.И. Степановым и Б. А. Афанасевичем. Согласно им, для классификации вторичного свечения большое значение имеет существование или отсутствие промежуточных процессов между поглощением энергии, возбуждающей люминесценцию, и излучением вторичного свечения (например, переходов между электронными уровнями, изменений колебательной энергии и т.п.). Такие промежуточные процессы характерны для люминесценции ( в частности они имеют место при неоптическом возбуждении люминесценции).
Люминесценцией называют избыточное над тепловым излучение тела при некоторой температуре, имеющее длительность, значительно превышающую период излучаемых световых волн (τ >с). Причиной люминесценции является возбуждение атома или молекулы, например внешним фотоном (фотолюминесценция), электрическим полем (электролюминесценция), при воздействии на вещество рентгеновского излучения (рентгенолюминесценция) и т.п.
По длительности «послесвечения» различают:
- флюоресценцию (излучение квантов прекращается очень быстро после прекращения внешнего возбуждения — примерно через с);
- фосфоресценцию (процесс излучения квантов продолжается некоторое время и после прекращения внешнего возбуждения; временные параметры «послесвечения» здесь гораздо больше (τ > с).
На рис. VII.5 изображены: процесс поглощения внешнего кванта света hvпогл (1); безызлучательный переход на уровень с энергией Е2, на котором время жизни гораздо больше, чем на уровне Е3 (оно равно = 10-3 с) (2); излучение фосфоресцентного кванта hvфосф (3); «резонансная» флуоресценция (4).
Из возбужденного состояния молекула переходит, как правило, безызлучательно на уровень с энергией Е2, а затем с излучением кванта энергии на уровень .
Для люминесценции в основном справедлив закон Стокса: максимум в спектре люминесценции сдвинут в сторону длинных волн относительно максимума спектра излучения, вызвавшего эту люминесценцию.
Иными словами, энергия излучаемого фотона не может быть больше поглощенного .
Рисунок 1. Энергетическая диаграмма люминесценции.
Если описывать механизм люминесценции в самом общем виде, то она представляет собой способ» помогающий молекулам избавиться от избыточной энергии, приобретенной после поглощения шиитов видимого, ультрафиолетового или рентгеновского диапазона, в результате химической реакции и т.д. Молекула может, например, поглотить квант ультрафиолетового света, а потом перераспределить его энергию так, что ее существенная часть перейдет в различные формы внутренней энергии. Квант, который «высветится», будет принадлежать уже видимому диапазону: <
Рисунок 2.Закон Стокса: максимум в спектре люминесценции сдвинут в сторону более длинных волн по сравнению с максимумом в спектре поглощения.
Это обстоятельство позволяет не только фиксировать по видимому свечению объекта присутствие в нем люминесцируюшего вещества, но и при соответствующем оборудовании получать картину распределения этого вещества в объеме предмета, как бы он ни был мал.
Например, микроспектрофлюориметр позволяет не только обнаружить люминесценцию хлорофилла и других органических веществ, входящих в состав сосновой иголки, но и получить полную картину их распределения по всему срезу этого весьма малого объекта. Отклонения от нормы в таком распределении служат надежным и весьма чувствительным индикатором загрязнения окружающей среды. Другие области применения этого довольно простого прибора (его можно использовать и в полевых условиях): токсикология, иммунология, онкология, криминалистика, геология и др.
В последние десятилетия стали широко применять и специальные флюрооресцирующие молекулы, добавляемые, например, к мембранным системам извне: флюоресцентные зонды ( нековалентная связь с мембраной) или флюоресцентные метки (химическая связь). Изменение флюоресценции зондов и меток позволяет обнаружить конформационные перестройки в белках.
На основании данных о люминесценции также можно судить о величине квантов энергии, запасаемой в молекуле. Наряду с данными о квантах поглощаемой энергии это позволяет рассчитывать расположение энергетических уровней молекулы. Люминесцентный метод позволяет судить по скорости возникновения и исчезновения люминесценции. Исходя из интенсивности люминесценции, можно делать заключения о процессах растраты энергии молекулой. Наконец, с помощью люминесцентного метода очень удобно исследовать состояние вещества: даже его незначительное изменение (агрегация, комплексообразование, изменение рН и т.д.). сказывается на люминесцентных свойствах.
Чувствительность метода весьма высока, он дает информацию присутствия того или иного вещества в образце в ничтожных концентрациях – (соответствующий показатель для спектального анализа ).
Использование люминесценции в биологии и медицине
Люминесцентный, качественный и количественный анализы
Люминесцентный анализ – совокупность методов для определения природы и состава вещества по спектру его люминесценции.
– качественный анализ – определение наличия (или отсутствия) каких-либо веществ (молекул) по форме спектра люминесценции. При этом можно изучать структуру молекул вещества; межмолекулярное взаимодействие; химические превращения.
– количественный анализ – определение количества вещества по интенсивности спектра люминесценции (можно обнаружить массу вещества ).
Если люминофором является растворенное вещество, то при невысокой оптической плотности раствора интенсивность люминесценции пропорционально концентрации раствора. Поэтому по интенсивности люминесценции можно судить о концентрации раствора. Для этого интенсивность люминесценции исследуемого раствора сравнивают с интенсивностью люминесценции раствора концентрация которого заранее известна. Неизвестную концентрацию находят по формуле
.
По методике исследования люменесцентный анализ можно представить следующей схемой.
Макроанализ – наблюдение невооруженным глазом люминесценции объектов, облученных УФ-излучением;
– проверка качества и сортировка пищевых продуктов.
– сортировка фармакологических средств.
– свечение волос, чешуек, ногей при диагностике их поражения грибком и лишаем.
Микроанализ – исследование люминесцирующих микрообъектов при помощи специальных люминесцентных микроскопов, в которых есть специальный осветитель, содержащий ртутную лампу со светофильтром, пропускающим УФ-излучение.
Флуоресцентные зонды
В некоторых медицинских исследованиях применяются специальные люминофоры, вводимые в организм и распределяющиеся по тканям в соответствии со своими свойствами. Такие люминофоры получили название флуоресцентных зондов. Например, при введении раствора такого люминофора в кровь он разносится по всему организму и диффундирует в дерму и эпидермис. Люминесценция возбуждается длинноволновым ультрафиолетовым излучением и наблюдается в видимом свете. В поверхностных тканях с пониженным кровоснабжением люминесценция проявляется позже, чем в тканях с нормальным кровоснабжением.
Флуоресцентные метки
Флуоресцирующие молекулы можно ковалентно связывать с определенными молекулами, и затем эту систему вводить в исследуемый объект. Такие молекулы называются флуоресцентными метками. Примером является использование флуоресцентно меченых антител. Если добавить такие антитела к суспенсии смеси клеток, то они связываются только с теми из них, на поверхности которых находятся специфические к данному антителу антигены. Возникает яркая люминесценция определенных клонов клеток, наблюдаемая в люминесцентном микроскопе. Данная методика используется в иммунологических исследованиях крови.
Фотобиологические процессы и их стадии
Изучение биофизических аспектов фотобиологических процессов является центральным разделом квантовой биофизики. К фотобиологическим относят процессы, начинающиеся с поглощением кванта света биологически важной молекулой и заканчивающиеся какой-либо физиологической реакцией (позитивной или негативной) на уровне организма. К таким процессам относятся:
– фотосинтез – синтез органических молекул за счет энергии солнечного света;
– фототаксис – движение организмов, например биобактерий, к свету или от света;
– фототропизм – поворот листьев или стеблей растений к свету или от света;
– зрение – превращение световой энергии в энергию нервного импульса в сетчатке глаза или в аналогичных фоторецепторах;
– действие ультрафиолетовых лучей (бактерицидное или бактериостатическое действие на микроорганизмы, мутагенное действие, канцерогенное действие, образование витамина D из провитаминов, эритемное действие на кожу, образование загара, терапевтические эффекты).
В настоящее время широкое применение получило применение освещения определенных участков тела пациентов с целью лечения. Это направление получило название фотомедицины. К нему относятся:
– ультрафиолетовая терапия, основанная на облучении поверхности тела УФ-лучами.
– ПУФО-терапия – облучение поверхности кожи ближним ультрафиолетом после приема больными фукомаринов (таких как псорален) с целью лечения псориаза и некоторых других кожных болезней.
– УФО крови – облучение крови больных УФ-лучами с целью улучшения общего состояния больных сердечно-сосудистыми и некоторыми другими заболеваниями.
– фотодинамическая терапия раковой болезни – избирательное разрушение раковых клеток и ткани при облучении зоны опухоли после приема больным фотосенсибилизаторов, таких как порфирины или фталоцианины.
– лазерная терапия – ускорение заживления ран, улучшение микроциркуляции или общего кровообращения при облучении светом лазера раны или крови больного без использования экзогенных сенсибилизаторов.
К фотобиологическим процессам также может быть отнесена биохемилюминесценция (сверхслабые свечении, биолюминесценция). Здесь, наоборот, определенные биохимические реакции сопровождаются появлением электронно-возбужденного продукта с последующим испусканием кванта люминесценции.
Фотобиологические процессы весьма разнообразны. Каждый из них состоит из многих стадий, начиная с акта поглощения кванта света и кончая физиологическими реакциями на уровне целого организма. Условно всякий фотобиологический процесс можно разбить на несколько стадий:
- поглощение кванта света;
- внутримолекулярные процессы размена энергией (фотофизические процессы);
- межмолекулярные процессы переноса энергии возбужденного состояния;
- первичный фотохимический акт;
- темновые реакции, заканчивающиеся образованием стабильных продуктов;
- биохимические реакции с участием фотопродуктов;
- общефизиологический ответ на действие света.
В настоящей главе будут рассмотрены преимущественно начальные, физико-химические стадии фотобиологических процессов. Первые три стадии фотохимического процесса одинаковы для процессов фотохимии и люминесценции, поэтому законы фотохимии имеют свои аналоги с законами люминесценции.
Первичный фотохимический акт – это химическая реакция, в которую вступает поглотившая квант света молекула из возбужденного синглетного или триплетного состояния.
Важнейей характеристикой фотобиологического процесса в целом и его первичной стадии в частности служит квантовый выход фотохимической реакции.
Действие ультрафиолетового излучения на белки и нуклеиновые кислоты.
Выяснение механизма действия ультрафиолетового излучения на белки и нуклеиновые кислоты имеет важное общебиологическое значение. С момента возникновения жизни на Земле доклеточные образования и одноклеточные организмы находились под сильным влиянием ультрафиолетового облучения. Под постоянным воздействием ультрафиолетовых лучей находятся живые организмы и в настоящее время. Ультрафиолетовое облучение, приводящее к гибели клеток, появлению мутаций или инактивации клеток, имеет важное практическое значение в медицине, генетике микроорганизмов и т.д. представляет интерес и проблема стимулирующего действия ультрафиолетового излучения на биологические и ферментативные процессы синтеза веществ.
Спектр ультрафиолетового излучения Солнца разделяют на три области: 1) 180-275 нм – коротковолновое излучение. Изменяет структуру белков и липоидов, оказывает бактерицидное действие; 2) 275-320 нм – средневолновое излучение. Оказывает антирахитическое и пигментообразующее действие, усиливает образование эпителия, стимулирует процессы регенерации в организмах; 3) 320-400 нм – длинноволновое излучение. Оказывает слабое биологическое действие, вызывает люминесценцию некоторых органических веществ.
Ультрафиолетовое излучение может вызвать такие фотобиологические реакции, которые приводят к деструкции белков и нуклеиновых кислот. Эти фотобиологические реакции вызывают и вторичные изменения, уже не связанные с непосредственным действием излучения. Первичные изменения состоят в нарушении структуры ДНК и в денатурации белков. Вторичные изменения наступают вследствие того, что клеточные ферменты расщепляют денатурированный белок. При этом накапливаются продукты распада. Продукты распада вызывают раздражение нервных окончаний, которое приводит к сложным рефлекторным реакциям.
В ультрафиолетовой области спектра (260 нм) сильно поглощают лучи только азотистые основания нуклеиновых кислот. По этой причине именно они подвергаются фотохимическим превращениям при ультрафиолетовом облучении. Наиболее важные реакции, идущие под действием ультрафиолетового излучения, это фотохимическое окисление, фотохимическое гидрирование (присоединение молекул воды к азотистым основаниям) и фотодимеризация. Фотодимеризация заключается в образовании устойчивой химической связи между двумя азотистыми основаниями под действием фотонов. При большой дозе ультрафиолетового облучения может происходить разрыв колец азотистых оснований.
Основное действие ультрафиолетовых лучей на нуклеиновую кислоту заключается в том, что последняя теряет биологическую активность, т.е. способность передавать заключенную в ней информацию. При этом основную роль в инактивации ДНК играют процессы димеризации тиминовых оснований. Процессы димеризации тиминовых оснований протекают раньше других фотохимических реакций. Когда еще не наблюдается заметного накопления гидрированных и окисленных оснований, инактивация ДНК уже происходит. Две молекулы тимина в двойной спирали ДНК никогда не расположены рядом. Более того, в силу компелементарности нитей в ДНК они никогда не расположены точно напротив друг друга. Под воздействием ультрафиолетовых лучей возникает местное расплетение нитей ДНК. Затем нити изгибаются таким образом, что тиминовые основания сближаются. Между ними возникает стойкая химическая связь, которая как бы стягивает двойную нить ДНК и препятствует считыванию с нее информации.
Ультрафиолетовое излучение оказывает сильное бактериостатическое и бактерицидное действие. При облучении ультрафиолетовыми лучами бактерий и вирусов происходит угнетение их активности, подавление способности к размножению и гибель. Механизм действия ультрафиолетового излучения на бактерии и вирусы был выявлен при изучении спектров действия инактивации этих организмов. Под спектром действия инактивации этих организмов. Под спектром действия понимают зависимость величины фотобиологического эффекта от длины волны излучения. Оказалось, что спектр действия инактивации при ультрафиолетовом облучении вирусов и бактерий совпадает со спектром поглощения нуклеиновых кислот (У.Винклер, 1962). Следовательно, основой бактерицидного действия ультрафиолетовых лучей является повреждение и инактивация нуклеиновых кислот. Для бактерий, кроме того, определенное значение имеет и повреждение ферментных систем.
Другая картина была получена при исследовании влияния ультрафиолетовых лучей на клетки млекопитающих. Для них излучения с длиной волны 260 и 280 нм обладают почти одинаковой эффективностью. Это указывает на то, что в клетках млекопитающих фотохимическое повреждение белков так же существенно, как и повреждение ДНК (И.П.Арман, 1971).
Бактерицидное действие ультрафиолетового излучения широко используется в лечебных и профилактических целях для облучения участков тела, содержащих инфекцию, для стерилизации различных предметов, веществ, продуктов питания и т.п.
Вредное влияние на организм человека оказывают лишь большие дозы облучения коротковолновыми лучами. Умеренные дозы ультрафиолетового облучения повышают общую и иммунную реактивность организма, что позволяет применять ультрафиолетовые лучи с лечебными и профилактическими целями. Особое значение ультрафиолетовое облучение имеет в процессе образования витамина D из 7,8-дегидрохолестерина и эргостерина. Облучение кожи вызывает разрыв двойной связи в кольце, что приводит к проявлению антирахи
Фотосенсибилизаторы и их применение в медицине
В тех случаях когда чувствительность ткани к данному виду облучения мала, ее можно повысить введением специальных добавок – фотосенсибилизаторов.
Фотосенсибилизатор – вещество, повышающее чувствительность биообъектов к свету.
В этом случае в первичных фотохимических реакциях участвуют молекулы фотосенсибилизатора, а продукты первичной реакции реагируют с молекулами ткани.
На использовании фотосенсибилизаторов основан метод подавления доступных для света опухолей – фотодинамическая терапия (ФДТ). В организм больного вводится специально подобранный фотосенсибилизатор, способный избирательно накапливаться в опухолевых тканях. При облучении ткани соответствующим светом молекулы фотосенсибилизатора вступают в фотодинамические реакции, продуцируя активные формы кислорода и свободные радикалы. Эти реакционноспособные частицы вызывают окислительные повреждение опухолей, приводящее к их гибели.
