Основные разновидности биологических мембран представлены на рисунке 9.2. Мембрану, ограничивающую цитоплазму клетки снаружи, называют цитоплазматической или плазматической мембраной (1). Название внутриклеточных мембран обычно происходит от названия ограничиваемых или образуемых ими субклеточных структур. Различают ядерную (2), митохондриальную (3), лизосомальную (4) мембраны, мембраны комплекса Гольджи (5), эндоплазматический ретикулум (6) и другие.

Рисунок 9.2. Схематическое изображение органелл животной клетки (объяснения в тексте).

9.2.2. Некоторые примеры функций биологических мембран.

Плазматическая мембрана – ограничивает содержимое клетки от внешней среды; осуществляет контакт с другими клетками, получение, обработку и передачу информации внутрь клетки, поддержание постоянства внутренней среды.

Ядерные мембраны (внешняя и внутренняя) – образуют ядерную оболочку, которая отделяет хромосомный материал от цитоплазматических органелл; через поры ядерной оболочки происходит транспорт белков и нуклеиновых кислот в ядро и из ядра.

Митохондриальные мембраны – осуществляют преобразование энергии в ходе окислительного фосфорилирования, синтез АТФ.

Лизосомальные мембраны – ограничивают гидролитические ферменты от цитоплазмы клетки, препятствуют самоперевариванию (аутолизу) клеток, способствуют поддержанию постоянства рН среды в лизосомах.

Мембраны эндоплазматического ретикулума – принимают участие в образовании новых мембран, осуществляют синтез белков, липидов, полисахаридов, окисление гидрофобных метаболитов и ксенобиотиков.

·        состоят из липидов, белков и углеводов;

·        являются плоскими замкнутыми структурами;

·        имеют внутреннюю и внешнюю поверхности (асимметричны);

·        избирательно проницаемы.

9.3.2. Схема строения биологической мембраны, представлена на рисунке 9.3. Основу мембраны составляет липидный бислой – двойной слой молекул липидов, которые обладают свойствомамфифильности (содержат как гидрофильные, так и гидрофобные функциональные группы). В липидном бислое гидрофобные участки молекул взаимодействуют между собой, а гидрофильные участки обращены в окружающую водную среду.

Рисунок 9.3. Схема строения биологической мембраны (по Сингеру и Николсону).

Мембранные липиды выполняют роль растворителя мембранных белков, создавая жидкую среду, в которой они могут функционировать. По степени влияния на структуру бислоя и по силе взаимодействия с ним мембранные белки делят на интегральные и периферические. Важнейшие особенности интегральных и периферических белков представлены в таблице 9.1.

Таблица 9.1

Характеристика мембранных белков

По выполняемым функциям белки в составе мембран делятся на

1.      структурные;

2.      каталитические;

3.      рецепторные;

4.      транспортные.

Количество белков в мембранах могут существенно отличаться. Например, в миелиновой мембране, предназначенной для изоляции нервных волокон, белки составляют только 25% массы мембраны, а в мембранах митохондрий, связанных с процессами окислительного фосфорилирования, на долю белков приходится около 75% массы. В плазматической мембране доля белков и липидов примерно одинаковы.

Углеводы в составе мембран не представлены самостоятельными соединениями, а обнаруживаются только в соединении с белками (гликопротеины) или липидами (гликолипиды). Длина углеводных цепей колеблется от двух до восемнадцати остатков моносахаридов. Большая часть углеводов расположена на наружной поверхности плазматической мембраны. Функции углеводов в биомембранах – контроль за межклеточными взаимодействиями, поддержание иммунного статуса, рецепция, обеспечение стабильности белковых молекул в мембране.

Рисунок 9.4. Наиболее часто встречающиеся природные жирные кислоты.

Основные особенности строения жирных кислот, входящих в состав природных жиров:

·        они содержат чётное число атомов углерода (С16 – С20);

·        двойная связь в ненасыщенных жирных кислотах располагается между 9 и 10 атомами углерода;

·        в полиненасыщенных жирных кислотах двойные связи разделены метиленовыми группами (СН=CH-CH2-CH=CH), то есть являются несопряжёнными;

·        двойные связи находятся в цис-конформации, что приводит к изгибу углеводородной цепи.

9.4.2. Большинство липидов в мембранах млекопитающих представлены фосфолипидами, гликосфинголипидами и холестеролом.

Фосфолипиды в составе мембран подразделяются на две группы: глицерофосфолипиды и сфингомиелины.

Глицерофосфолипиды – представляют собой сложные эфиры трёхатомного спирта глицерола, двух остатков жирных кислот и фосфорилированного аминоспирта. Общая формула глицерофосфолипида представлена на рисунке 9.5.

Наиболее распространённым глицерофосфолипидом мембран является фосфатидилхолин:

В глицерофосфолипидах у второго углеродного атома глицерола обязательно находится остаток ненасыщенной жирной кислоты (в данном случае линолевой).

Рисунок 9.5. Общая формула глицерофосфолипидов.

Сфингофосфолипиды (сфингомиелины) являются производными аминоспирта сфингозина (рисунок 9.6). Соединение сфингозина и жирной кислоты получило название церамид.

Рисунок 9.6. Структурные формулы сфингозина и его производных.

В сфингомиелинах водород гидроксильной группы у первого углеродного атома в церамиде замещён на фосфохолин. Пример сфингомиелина, содержащего остаток олеиновой кислоты:

Гликолипиды также являются производными церамида, содержащими один или несколько остатков моносахаридов. Например, цереброзиды содержат в первом положении остаток глюкозы или галактозы:

а ганглиозиды содержат цепочку из нескольких остатков сахаров, одним из которых обязательно является сиаловая кислота.

Холестерол (рисунок 9.7) – одноатомный циклический спирт. Это один из главных компонентов плазматической мембраны клеток млекопитающих, в меньшем количестве может присутствовать также в митохондриях, мембранах комплекса Гольджи, ядерных мембранах. Особенно много его в нервной ткани.

Рисунок 9.7. Структурные формулы холестерола и его эфира.

9.4.3. Как уже было сказано, характерной особенностью мембранных липидов является их амфифильность – наличие в молекуле одновременно гидрофобных и гидрофильных участков. Гидрофобная часть молекулы представлена остатками жирных кислот и боковой цепью сфингозина.

Гидрофильные участки представлены в фосфолипидах фосфорилированным спиртом, а в гликолипидах – остатками сахаров. Амфифильность холестерола выражена слабо – циклическая структура и боковой радикал гидрофобны, и только гидроксильная группа гидрофильна.

Амфифильность мембранных липидов определяет характер их поведения в водной среде. Слипание гидрофобных участков молекул приводит к образованию упорядоченных замкнутых структур – мицелл, в которых гидрофобные области защищены от воды, а гидрофильные обращены в водную среду.

Молекулы холестерола встраиваются между радикалами жирных кислот гидрофобной части бислоя, а его гидроксильная группа примыкает к гидрофильным головкам фосфолипидов. Такая структура, стабилизированная нековалентными гидрофобными взаимодействиями, термодинамически очень устойчива и лежит в основе формирования биологических мембран.

9.4.4. Замкнутый липидный бислой определяет основные свойства мембран:

1) текучесть – зависит от соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в составе мембранных липидов. Гидрофобные цепочки насыщенных жирных кислот ориентированы параллельно друг другу и образуют жёсткую кристаллическую структуру (рисунок 9.8, а). Ненасыщенные жирные кислоты, имеющие изогнутую углеводородную цепь, нарушают компактность упаковки и придают мембране бóльшую жидкостность (рисунок 9.8, б). Холестерол, встраиваясь между жирными кислотами, уплотняет их и повышает жёсткость мембран.

Рисунок 9.8. Влияние жирнокислотного состава фосфолипидов на текучесть липидного бислоя.

2) латеральная диффузия – свободное перемещение молекул относительно друг друга в плоскости мембран (рисунок 9.9,а).

Рисунок 9.9. Виды перемещений фосфолипидных молекул в липидном бислое.

3) ограниченная способность к поперечной диффузии (переходу молекул из наружного слоя во внутренний и наоборот, см. рисунок 9.9, б), что способствует сохранению асимметрии – структурно-функциональных различий наружного и внутреннего слоёв мембраны.

4) непроницаемость замкнутого бислоя для большинства водорастворимых молекул.

ЛИПИДНЫЙ БИСЛОЙ

АБВГДЕЖЗИКЛМНОПРСТУФХЦЧШЩЭЮЯ

ЛИПИДНЫЙ БИСЛОЙ (бимолекулярный липидный слой), термодинамически выгодная форма ассоциации мн. полярных липидов в водной среде, при к-рой молекулы липидов ориентированы таким образом, что их полярные головки обращены в сторону водной фазы и формируют две гидрофильные пов-сти, а углеводородные цепи расположены приблизительно под прямым углом к этим пов-стям и образуют между ними гидрофобную область (см. рис.). Липидный бислой – основа мол. организации мембран биологических. Легко формируется липидами, у к-рых невелики различия между площадью поперечного сечения головки и углеводородных цепей. Это свойственно большинству фосфолипидов биол. мембран. Характерный признак липидов, образующих липидный бислой, – низкая величина критич. концентрации мицеллообразования (ок. 10^-10 М). Толщина липидного бислоя определяется прежде всего длиной углеводородных цепей и обычно находится в пределах 4-5 нм. Присутствие в цепях цис-двойных связей, боковых метильных групп и др. заместителей нарушает плотность упаковки молекул и приводит к уменьшению толщины бислоя. В зависимости от т-ры липидный бислой может находиться в двух состояниях – кристаллическом (гелевом) и жидкокристаллическом.

Схема липидного бислоя: 1 – полярная головка молекулы; 2 – углеводородная цепь.

Переход из одного состояния в другое связан с плавлением углеводородной фазы бислоя и происходит при строго определенной т-ре (Т_ф.п.), характерной для каждого липида. Наиб. высокой Т_ф.п. обладают липиды с неразветвленными насыщенными углеводородными цепями. Наличие заместителей и особенно цис-двойных связей в углеводородных цепях понижает Т_ф.п.. При т-рах ниже Т_ф.п. углеводородные цепи липидных молекул имеют максимально вытянутую трансоидную конформацию, плотно упакованы и обладают ограниченной подвижностью. Плавление углеводородной фазы сопровождается резким усилением подвижности цепей в результате их транс-, гош-изомеризации. Вследствие близкого расположения в бислое соседних цепей, препятствующих своб. вращению вокруг связей С—С, изомеризация происходит в виде сопряженных поворотов в смежных звеньях углеводородных цепей. В жидкокристаллич. состоянии липидные молекулы способны легко мигрировать вдоль пов-сти бислоя. Коэф. латеральной диффузии липидов лежит в пределах 10^-7 -10^-9 см²/с. При переходе бислоя в гелевое состояние скорость такой диффузии резко падает. Миграция липидных молекул с одной стороны бислоя на другую (т. наз. флип-флоп) происходит медленно. Полупериод флип-флопа составляет неск. часов или даже дней, что обусловлено необходимостью преодоления высокого энергетич. барьера при переносе полярной головки липидной молекулы через гидрофобную область бислоя. Распределение молекул в плоскости липидного бислоя может быть неоднородным и зависит от состава липидов, фазового состояния, а также присутствия мембраноактивных в-в. Такое распределение, приводящее к образованию липидных доменов (кластеров) разного состава, происходит, если липиды различаются по структуре полярных головок, углеводородные цепи отличаются по длине более чем на две метиленовые группы и имеют разную степень ненасыщенности. Распределение липидов между сторонами бислоя также м. б. неодинаковым и зависит от его кривизны, соотношения размеров полярных и неполярных частей липидной молекулы, ее заряда и др. Искусств. мембраны, построенные на основе липидного бислоя, позволяют воспроизвести в модельных системах (напр., в липосомах) мн. ф-ции и характеристики биол. мембран.

Мембранные белки.

По способу ассоциации с липидным бислоем делятся на:

– поверхностные (периферические)- связанны с гидрофильной поверхностью липидного бислоя. Соединены с полярными головками липидов нековалентными связями (ионными, водородными) либо с частью интегрального белка, оказавшейся на гидрофильной поверхности бислоя;

– интегральные – погружены в гидрофобную область. Различаются по степени погруженности в бислой. Трансмембранные белки могут в виде альфа-спирали пересекать мембрану. Некоторые белки способны проникать только на расстояние одного монослоя мембраны.

Интегральные белки подобно липидам являются амфифильными соединениями:

Их гидрофобные области взаимодействуют с гидрофобными радикалами липидов, а гидрофильные части обращены к воде внутренней и окруж. среды.

Функции мембранных белков:

1.    Структурные белки – поддерживают структуру мембраны.  Являются в основном периферическими белками.

2.    Динамические белки – непосредственно участвуют в процессах, происходящих на мембране. Существует 3 класса таких белков:

–         транспортные – участвуют в трансмембранном переносе веществ;

–          каталитические – ферменты, интегрированные в мембрану и катализирующие там реакции;

–         рецепторные – мембранные рецепторы, специфически связывающие такие соединения как гормоны, нейромедиаторы, токсины, что служит началом для изменения метаболических процессов в мембране и внутри клетки.

Лизосомальные ферменты разрушают макромолекулы либо самой клетки (например, когда перерабатываются структурные компоненты клетки), либо захваченные извне. Унаследованные дефекты или недостатки лизосомальных ферментов (или других лизосомальных компонентов) могут привести к накоплению недеградированных метаболитов. По наличию многочисленных конкретных недостатков болезни накопления обычно группируют биохимически в зависимости от накапливаемого метаболита. Подгруппы включают:

·        Мукополисахаридоз

·        Сфинголипидоз (липидозы)

·        Муколипидоз

Наиболее важными являются мукополисахаридоз и сфинголипидоз. Тип 2 гликогеноза является расстройством лизосомального накопления, но большинство гликогенозов – нет.

Поскольку ретикулоэндотелиальные клетки (например, в селезенке) богаты лизосомами, ретикулоэндотелиальная ткань повреждается при ряде болезней лизосомального накопления, но, как правило, ткани, наиболее богатые субстратом, страдают сильнее всего. Таким образом, мозг, который богат ганглиозидами, особенно страдает от ганглиозидоза, тогда как мукополисахаридоз влияет на многие ткани, потому что мукополисахариды присутствуют во всем теле.

Мукополисахаридоз (MPS)

Мукополисахаридоз – передаваемый по наследству недостаток ферментов, участвующих в разрушении гликозаминогликана. Гликозаминогликаны (ранее называвшиеся мукополисахаридами) являются обычными полисахаридами поверхности клеток и внеклеточного матрикса и структур. Дефициты ферментов, препятствующие разрушению гликозаминогликана, вызывают накопление фрагментов гликозаминогликана в лизосомах и вызывают обширные изменения костей, мягких тканей и ЦНС. Наследование, как правило, аутосомно-рецессивное (кроме мукополисахаридоза типа II).

Возраст возникновения, клинические проявления и тяжесть варьируются в зависимости от типа. Общие проявления включают грубые черты лица, задержку нервного развития и регресс, контрактуры суставов, органомегалию, жесткие волосы, прогрессирующую дыхательную недостаточность (в связи с обструкцией дыхательных путей и ночным апноэ), сердечные пороки, скелетные изменения и подвывих шейных позвонков.

Диагноз предполагают на основании истории болезни, данных осмотра, костных аномалий (например, множественных дизостозов), обнаруженных при исследовании скелета, и повышенного общего и фракционированного гликозаминогликанов. Диагноз подтверждают анализом ферментов в культуре фибробластов (пренатально) или периферических лейкоцитов (после рождения). Дополнительное тестирование проводят для контроля орган-специфических изменений (например, эхокардиография для пороков клапанов, аудиометрия для выявления изменений слуха).

Лечение мукополисахаридоза типа I (болезнь Херлера) состоит в восполнении фермента α-L-идуронидазы, которая эффективно останавливает прогрессирование и восстанавливает все не-ЦНС-осложнения заболевания. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) также оказалась эффективной в начале исследований, но неэффективна при заболевании ЦНС. Сочетание восполнения ферментов и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток исследуется.

Сфинголипидоз

Сфинголипиды – нормальные липидные компоненты клеточных мембран, они накапливаются в лизосомах и вызывают обширные изменения нейронов, костей и другие изменения, когда дефект фермента предотвращает их разрушение. Хотя заболеваемость низкая, частота носительства некоторых форм высока. Болезнь Гоше является наиболее распространенным финголипидозом. Другие включают болезни Ниманна – Пика, Тея – Сакса, Сандоффа, Фабри, Краббе, а также болезнь накопления эфиров холестерина и метахроматическую лейкодистрофию.

БОЛЕЗНЬ НИМАННА-ПИКА

Болезнь Ниманна – Пика – сфинголипидоз, вызванный недостаточной активностью сфингомиелиназы, что приводит к накоплению сфингомиелина (церамид фосфорилхолин) ретикулоэндотелиальных клетках.

Болезнь Ниманна – Пика наследуется аутосомно-рецессивно и чаще всего появляется у евреев ашкенази; существует 2 типа: А и В. Тип С болезни Ниманна – Пика связан с дефектами ферментов, вовлекающих аномальное хранение холестерина.

Пациенты с типом А имеют <5% нормальной активности сфингомиелиназы. Заболевание характеризуется гепатоспленомегалией, задержкой развития и быстро прогрессирующей нейродегенерацией. Смерть наступает в возрасте 2 или 3 лет.

У пациентов с типом B активность сфингомиелиназы составляет 5–10% от нормальной. Тип B имеет более варьирующиеся клинические проявления, чем тип А. Могут развиться гепатоспленомегалия и лимфаденопатия. Панцитопения довольно распространена. Большинство пациентов с типом B практически не имеют неврологических поражениий и доживают до взрослого возраста, они могут быть клинически неотличимы от лиц с болезнью Гоше типа I. В тяжелых случаях типа B прогрессирующие легочные инфильтраты вызывают основные осложнения.

Диагностика

·        Пренатальный скрининг

·        Исследование сфингомиелиназы лейкоцитов

Оба типа обычно подозревают по истории болезни и результатам исследований, в первую очередь гепатоспленомегалии. Диагноз может быть подтвержден анализом сфингомиелиназы лейкоцитов, и это может быть сделано пренатально с помощью амниоцентеза или биопсии хориона.

Лечение

Трансплантацию костного мозга или стволовых клеток исследуют в качестве возможного варианта лечения.

12.

ОСНОВЫ БИОЭНЕРГЕТИКИ

Биоэнергетика – это раздел биохимии, изучающий преобразование и использование энергии в живых клетках.

Всем живым организмам необходима энергия из внешней среды, т.е. любая живая клетка обеспечивает свои энергетические потребности за счет внешних ресурсов. К таким энергетическим ресурсам можно отнести питательные вещества, расщепляющиеся в клетке до менее энергетически ценных конечных продуктов. В главе 5 речь уже шла о выделении энергии при катаболических процессах. Теперь настало время показать, каким образом катаболизм связан с накоплением энергии в форме АТФ.

Освобождение энергии при катаболизме питательных веществ. При рассмотрении катаболизма различных субстратов условно можно выделить три этапа освобождения энергии.

Первый этап – подготовительный. На этом этапе происходит расщепление биополимеров, поступающих с пищей или находящихся внутри клетки, до мономеров. Энергетической значимости этот этап практически не имеет, так как происходит освобождение лишь 1% или менее энергии субстратов. Извлеченная на этом этапе энергия рассеивается в виде тепла.

Второй этап характеризуется частичным распадом мономеров до таких соединений, как ацетил-КоА и метаболиты цикла Кребса – щавелевоуксусная, α-кетоглутаровая, фумаровая кислоты. На втором этапе число субстратов сокращается до нескольких. На этом этапе происходит освобождение до 20% энергии, заключенной в исходных субстратах, происходящее в анаэробных условиях. Часть этой энергии аккумулируется

143

в фосфатных связях АТФ, а остальная рассеивается в виде тепла.

АТФ в анаэробных условиях образуется из АДФ и фосфата, снятою с субстрата. Процесс образования АТФ из АДФ и фосфата, снятого с субстрата, называется субстратным фосфорилированием. В процессе гликолиза можно найти два примера вышеназванного процесса:

1,3-Дифосфоглицериновая кислота + АДФ → 3-Фосфоглицериновая кислота + АТФ;

2-Фосфоенолпировиноградная к-та + АДФ → Енолпировиноградная к-та + АТФ.

Однако посредством реакций субстратного фосфорилирования образуется сравнительно небольшое количество АТФ.

Третий этап – это окончательный распад метаболитов до оксида углерода (IV) и воды. Он протекает в аэробных условиях и представляет собой биологическое окисление. Метаболиты, оставшиеся после второго этапа освобождения энергии, поступают в цикл Кребса, результатом которого являются восстановленные формы коферментов НАД и ФАД. Связь катаболизма глюкозы и высших жирных кислот с циклом Кребса установить нетрудно (см. главы 7 и 8). Особого рассмотрения требует катаболизм аминокислот, поскольку хорошо известно, что белки являются энергетически ценными питательными веществами, хотя и в меньшей степени, чем углеводы и триглицериды. Рисунок 21 дает представление о том, каким образом аминокислоты, претерпевая превращения, происходящие на втором этапе освобождения энергии, связаны с циклом Кребса. Снятый с метаболитов цикла Кребса водород является универсальным энергетическим топливом для ансамбля ферментов, локализованных во внутренней мембране митохондрий. Этот ансамбль представляет собой цепь оксидоредуктаз, где сопряженно с переносом протонов и электронов на молекулярный кислород происходит активирование неорганического фосфата и далее – фосфорилирование АДФ с образованием АТФ. Окисление, сопряженное с синтезом АТФ, называется сопряжением на уровне электронотранспортной цепи. Иначе этот процесс называют окислительным фосфорилированием и отождествляют с дыханием.

Примерно 80% всей энергии химических связей веществ освобождается на этом этапе. Еще раз подчеркнем, что все процессы данного этапа освобождения энергии локализованы в митохондриях
Рис. 21. Связь катаболизма аминокислот с циклом Кребса

Веществами, через которые реализуется энергетика организмов, являются макро-эргические соединения, характеризующиеся наличием фосфатных групп. Роль этих соединений в процессах превращения энергии в организме впервые установил, изучая мышечное сокращение, советский биохимик В. А. Энгельгардт. В дальнейшем работами многих исследователей было показано, что эти соединения участвуют в аккумуляции и трансформации энергии при всех жизненных процессах. Энергия, освобождающаяся при отщеплении фосфатных групп, может использоваться для синтеза биологически важных веществ с повышенным запасом свободной энергии и для процессов жизнедеятельности, связанных с превращением свободной химической энергии в работу (механическую, активного переноса веществ, электрическую и т.д.). Важнейшим из этих соединений веществом, играющим для всего живого мира роль почти единственного трансформатора и передатчика энергии, является аденозинтрифосфорная кислота – АТФ (см. Аденозинфосфорные кислоты), расщепляющаяся до аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) или аденозинмонофосфорной кислоты (АМФ). Гидролиз АТФ, т. е. отщепление от неё конечной фосфатной группы, протекает по уравнению:

АТФ + H₂O ® АДФ + фосфат

и сопровождается уменьшением свободной энергии на значение DF. Если эта реакция протекает при концентрации всех реагентов и продуктов в 1,0 моль при 25°С и pH 7,0, то свободная энергия АДФ оказывается меньше свободной энергии АТФ на 29,3 кдж (7000 кал). В клетке это изменение свободной энергии больше: DF=50 кдж/моль (12 000 кал/моль). Значения DF для реакции АТФ®АДФ выше, чем у большинства реакций гидролиза. Макроэргическими называют и сами связи третьей (конечной) и второй фосфатных групп в молекуле АТФ и аналогичные связи в других макроэргических соединениях. Эти связи обозначают знаком ~ (тильда); например, формулу АТФ можно записать так: аденин – рибоза – фосфат ~ фосфат ~ фосфат. Говоря об энергии макроэргических связей, в Биоэнергетика имеют в виду не действительную энергию ковалентной связи между атомами фосфора и кислорода (или азота), как это принято в физической химии, а лишь разность между значениями свободной энергии (DF) исходных реагентов и продуктов реакций гидролиза АТФ или других аналогичных реакций. «Энергия связи» в этом смысле, строго говоря, не локализована в данной связи, а характеризует реакцию в целом.

13.

Тканевое дыхание, клеточное дыхание, совокупность ферментативных процессов, протекающих при участии кислорода воздуха в клетках органов и тканей, в результате

чего продукты расщепления углеводов, жиров, белков окисляются до углекислого газа и воды, а значит, часть освобождающейся энергии запасается в форме богатых энергией, или макроэргических соединений. Тканевое дыхание отличают от внешнего дыхания — совокупности физиологических процессов, обеспечивающих поступление в организм кислорода и выведение из него углекислого газа. Многие ферменты, катализирующие эти реакции, находятся в особых клеточных органоидах — митохондриях.

  На все проявления жизни — рост, движение, раздражимость, самовоспроизведение и др. — организм расходует энергию. Формой энергии, пригодной для использования клетками, является энергия химических связей (главным образом фосфатных) в макроэргических соединениях — аденозинтрифосфорной кислоте (АТФ) и др. Для синтеза АТФ необходим приток энергии извне. По способам извлечения энергии существует принципиальное различие между автотрофными организмами и гетеротрофными организмами. Клетки зелёных растений — наиболее типичных автотрофов — в процессе фотосинтеза используют энергию солнечного света для синтеза АТФ и глюкозы. (Образование из глюкозыболее сложных молекул происходит в клетках растений также в процессе Тканевое дыхание) В клетках гетеротрофов — животных и человека — единственным источником энергии является энергия химических связей молекул пищевых веществ. Молекулы различных соединений, выполняющие роль биологического «топлива» (глюкоза, жирные кислоты, некоторые аминокислоты), образовавшись в клетках животного организма или поступив в кровь из пищеварительного тракта, претерпевают ряд последовательных химических превращений. В процессе Тканевое дыхание можно наметить три основные стадии: 1) окислительное образование ацетилкофермента А (активная форма уксусной кислоты) из пировиноградной кислоты (промежуточный продукт расщепления глюкозы), жирных кислот и аминокислот; 2) разрушение ацетильных остатков в трикарбоновых кислот цикле с освобождением 2 молекул углекислого газа и 4 пар атомов водорода, частично акцептируемых коферментами никотинамидадениндинуклеотидом и флавинадениндинуклеотидом и частично переходящих в раствор в виде протонов; 3) перенос электронов и протонов к молекулярному кислороду (образование H₂O) — процесс, катализируемый набором дыхательных ферментов и сопряжённый с образованием АТФ (так называемое окислительное фосфорилирование). Первые две стадии подготавливают третью, в ходе которой в результате последовательных окислительно-восстановительных реакций происходит освобождение основной части энергии, вырабатываемой в клетке. При этом около 50% энергии в результате окислительного фосфорилирования запасается в форме богатых энергией связей АТФ, а остальная часть её выделяется в виде тепла.

Тканевое дыхание обеспечивает образование и постоянное пополнение АТФ в клетках. В случае недостатка в снабжении клеток животных и человека кислородом запасы АТФ не исчерпываются сразу. Их пополнение может происходить в результате включения дополнительных механизмов — систем анаэробного (без участия кислорода) распада углеводов — гликолиза и гликогенолиза. Однако этот путь энергетически во много раз менее эффективен и не может обеспечить функции и целостность структуры органов и тканей. Биологическая роль Тканевое дыхание не исчерпывается существенным вкладом в энергетический обмен организма. На различных его этапах образуются молекулы органических соединений, используемых клетками в качестве промежуточных продуктов для различных биосинтезов.

Тканевое дыхание – это совокупность реакций аэробного окисления органических молекул в клетке, при которых молекулярный кислород является обязательным субстратом для образования продуктов окисления. Однако использоваться клеткой кислород может для разных задач:

1. во внутренней мембране митохондрий кислород является конечным акцептором электронов от окисляемых субстратов (НАДН·Н⁺ или ФАДН₂) с возможностью включения его активной формы (оксид-анион; атомарный кислород) в молекулу воды – одного из конечных продуктов окисления органических молекул в клетках аэробного типа;

2. монооксигеназные системы внутренней мембраны митохондрий или мембран эндоплазматического ретикулума (ЭПР) используют один атом молекулярного кислорода для его включения в молекулы органических субстратов с целью модификации их структуры и появления таких функциональных групп, как гидроксильная, кето-, альдегидная, карбоксильная группы;

3. диоксигеназные системы ЭПР используют два атома молекулярного кислорода для образования перекисных соединений тип R₂O₂. Такие перекиси клетка утилизирует благодаря антиоксидантным ферментативным системам: глутатионпероксидаза и др..

Задача 1 выполняется клеткой аэробного типа преимущественно тогда, когда в клетке появляются вещества-энергоисточники, и есть необходимость для продукции энергии путем включения этих веществ–энергоисточников в катаболические пути. Тканевое дыхание клетки можно представить в виде стадий, их три:

1 стадия тканевого дыхания – 2-я стадия катаболических процессов;

2 стадия тканевого дыхания – Цикл Трикарбоновых Кислот (ЦТК);

3 стадия тканевого дыхания – функция дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий.

1-я и 2-я стадии тканевого дыхания продуцируют в цитозоле и в матриксе митохондрий восстановленные формы коферментов и простетических групп – потенциальные доноры электронов в дыхательную цепь внутренней мембраны митохондрий. Именно в этой мембране присутствует специальный комплекс ферментов и липофильных веществ (убихинон; коэнзим Q), который переносит электроны от восстановленных форм коферментов (НАДН) и простетических групп (ФАДН₂) на атомарный кислород.

В структуре митохондрий выделяют наружную мембрану, внутреннюю мембрану, матрикс, межмембранное пространство. В матриксе и, частично, во внутренней мембране локализованы процессы первой и второй стадий тканевого дыхания: бета-окисление высших жирных кислот, реакции обмена аминокислот – окислительное дезаминирование, трансаминирование, цикл Кребса (ЦТК) за исключением сукцинатдегидрогеназной реакции.

Обе мембраны пронизывают транспортные системы, отвечающие за:

1. транспорт аминокислот;

2. транспорт АТФ/АДФ;

3. транспорт ионов;

4. челночные системы (малат-аспартатная, глицеролфосфатная), осуществляющие транспорт электронов и протонов от цитозольных форм восстановленных коферментов в матрикс и во внутреннюю мембрану;

5. транспорт трикарбоновых кислот;

6. транспорт ацилов ВЖК;

7. транспорт катионов и анионов.

Транспортные системы обеспечивают постоянство состава матрикса митохондрии, обмен веществами с цитоплазмой, доставку образующихся субстратов из матрикса в цитоплазму для нужд клетки.

Наиболее важной с энергетической точки зрения является третья стадия тканевого дыхания, т.е. функция дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий. Дыхательная цепь состоит из переносчиков электронов от восстановленных форм коферментов на кислород. Переносчики элетронов объединены в комплексы дыхательной цепи. Деление участников дыхательной цепи на комплексы (I-IV) возникло в ходе экспериментальных исследований по выделению и разделению компонентов дыхательной цепи с целью изучения их структуры и функции.

Комплекс I дыхательной цепи состоит из трансмембранного белка-фермента НАДН-дегидрогеназы (небелковая часть – ФМН) и железосеросодержащих белков (FeS-белки). Из матрикса НАДН-формы мигрируют во внутреннюю мембрану митохондрий, где их захватывает флавопротеин НАДН–дегидрогеназа. Протекает окислительно-восстановительная реакция:

НАДН·Н⁺ + ФМН·ДГаза ® НАД⁺ + ФМНН₂·ДГаза

ФМН ФМНН₂

Восстановленная форма НАДН-ДГазы через FeS-белки комплекса I передает электроны убихинону (КоQ), а протоны убихинон может захватывать из матрикса:

KoQ KoQH₂

Убихинон – очень липофильная структура, свободно двигающаяся в направлении от поверхности внутренней мембраны, обращенной к матриксу (КоQH₂), к поверхности внутренней мембраны, обращенной к межмембранному пространству (ММП) и обратно (КоQ). Восстановленная форма убихинона отдает электроны комплексу III дыхательной цепи, содержащему цитохромы в, с₁ и FeS-белки. Цитохромы в и с₁ – гемопротеины третичной структуры. Особенностью гемов является наличие в них катионов железа, меняющих степень окисления Fe²⁺/Fe³⁺. Гем цитохромов в , с₁или с способен принять только 1 ē, поэтому для передачи 2ē, которые транспортирует дыхательная цепь от окисляемого субстрата (восстановленной формы кофермента), нужны два цитохрома каждого типа. Цитохромы в , с₁ и с не способны принимать в свою структуру ионы Н⁺. Следующим акцептором электронов является цитохром с (самый подвижный во внутренней мембране цитохром; не входит ни в один комплекс), это тоже гемопротеин третичной структуры.

Восстановленная форма цитохрома с (Fe²⁺) отдает далее электроны цитохром с-оксидазе (ЦХО). Цитохром с-оксидаза – трансмембранный белок, гемопротеин четвертичной структуры, состоящий из шести субъединиц: 4а и 2а₃, последние содержат только Cu²⁺/Cu⁺. Данный белок называют также комплексом IV дыхательной цепи. Цитохром с-оксидаза, получая 4ē от цитохромов С (Fe²⁺), приобретает высокое сродство к молекулярному кислороду. Каждая пара электронов переходит на 1 атом молекулярного кислорода с формированием оксид-аниона, которые соединяясь с четырьмя протонами дают образование эндогенной воды: 4Н⁺+4 ē +О₂→2Н₂О

Убихинон способен забирать электроны от восстановленной формы ФАДН₂·СукцинатДГазы, которая образует вместе с FeS-белками и цитохромом в₅₆₀комплекс II дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрий. Таким образом, убихинон является коллектором, собирающим электроны от окисляемых субстратов и, передавая их дальше цитохромам (рис.29):

Дегидрирование субстрата и окисление водорода (образование Н2О) как источник энергии для синтеза АТФ. НАД- и ФАД-зависимые дегидрогеназы, убихинон-дегидрогеназа, цитохромы и цитохромоксидаза. Энергия освобождается в процессе ферментативного окисления метаболитов специфическими дегидрогеназами. В реакциях дегидрирования электроны и протоны переходят от органических субстратов на коферменты NAD- и FAD-зависимых дегидрогеназ. Электроны, обладающие высоким энергетическим потенциалом, передаются от восстановленных коферментов NADH и FADH2 к кислороду через цепь переносчиков, локализованных во внутренней мембране митохондрий. Восстановление молекулы О2 происходит в результате переноса 4 электронов. При каждом присоединении к кислороду 2 электронов, поступающих к нему по цепи переносчиков, из матрикса поглощаются 2 протона, в результате чего образуется молекула Н2О. Окисление органических веществ в клетках, сопровождающееся потреблением кислорода и синтезом воды, называют тканевым дыханием, а цепь переноса электронов (ЦПЭ) – дыхательной цепью. Электроны, поступающие в ЦПЭ, по мере их продвижения от одного переносчика к другому теряют свободную энергию. Значительная часть этой энергии запасается в форме АТФ, а часть энергии рассеивается в виде тепла. Кроме того, электроны с высоким энергетическим потенциалом, возникающие при окислении различных субстратов, могут быть использованы в реакциях биосинтеза, для которых помимо АТФ требуются восстановительные эквиваленты, например NADPH. Перенос электронов от окисляемых субстратов к кислороду происходит в несколько этапов. В нём участвует большое количество промежуточных переносчиков, каждый из которых способен присоединять электроны от предыдущего компонента и передавать следующему. Так возникает цепь окислительно-восстановительных реакций, в результате чего происходят восстановление О2 и синтез Н2О. В дыхательную цепь митохондрий входит большое число переносчиков. За исключением убихинона (KoQ), все компоненты ЦПЭ – белки. В составе этих белков содержатся различные небелковые компоненты: FMN, Fe в составе железо-серных белков и в составе порфириновых колец, ионы Сu.  Первичные акцепторы водорода .Первичные акцепторы водорода окислительно-восстановительных реакций относят к 2 типам дегидрогеназ: никотинамвдзависимым, содержащим в качестве коферментов производные никотиновой кислоты, и флавинзависимым, содержащим производные рибофлавина . Никотинамидзависимые дегидрогеназы содержат в качестве коферментов NAD+ или NADP+ (см. раздел 2). NAD+ и NADP+ – производные витамина PP. Эти коферменты входят в состав активных центров дегидрогеназ, но могут обратимо диссоциировать из комплекса с апоферментами и включаются в состав фермента в ходе реакции. Субстраты NAD- и NADP-зависимых дегидрогеназ находятся в матриксе митохондрий и в цитозоле. Рабочей частью никотинамидных коферментов служит никотинамид. Большинство дегидрогеназ, поставляющих электроны в ЦПЭ, содержат NAD+. Они катализируют реакции типа: R-CHOH-R1 + NAD+↔ R-CO-R1 + NADH + Н+. Таким образом, NAD+, присоединяя протоны и электроны от различных субстратов, служит главным коллектором энергии окисляемых веществ и главным источником электронов, обладающих высоким энергетическим потенциалом, для ЦПЭ. NADPH не является непосредственным донором электронов в ЦПЭ, а используется почти исключительно в восстановительных биосинтезах . Однако возможно включение электронов с NADPH в ЦПЭ благодаря действию пиридиннуклеотид трансгидрогеназы, катализирующей реакцию: NADPH + NAD+ ↔ NADP+ + NADH. Флавиновые дегидрогеназы содержат в качестве коферментов FAD или FMN. Эти коферменты образуются в организме человека из витамина В2. Флавиновые коферменты прочно связаны с апоферментами. Рабочей частью FAD и FMN служит изоаллоксазиновая сопряжённая циклическая система. FAD служит акцептором электронов от многих субстратов в реакциях типа: R-CH2-CH2-R1 + Е (FAD) ↔ R-CH=CH-R1 + Е (FADH2), где Е – белковая часть фермента. Большинство FAD-зависимых дегидрогеназ – растворимые белки, локализованные в матриксе митохондрий. Исключение составляет сукцинат-дегидрогеназа, находящаяся во внутренней мембране митохондрий. К FMN-содержащим ферментам принадлежит NADH-дегидрогеназа, которая также локализована во внутренней мембране митохондрий; она окисляет NADH, образующийся в митохондриальном матриксе. Цепь переноса электронов от NADH и FADH2 на кислород Перенос электронов от NADH к О2 включает ряд переносчиков, которые локализованы во внутренней мембране митохондрий. За исключением убихинона и цитохрома С, это сложные белковые комплексы. NADH-дегидрогеназа (NADH-Q-редуктаза, комплекс I) состоит из нескольких полипептидных цепей. Роль простетической группы играет FMN. Единственный субстрат фермента – NADH, с которого 2 электрона и протон переносятся на FMN с образованием FMNH2. Второй протон поглощается из матрикса. Реакция протекает по уравнению: NADH + Н+ + Е (FMN) → NAD+ + Е (FMNH2) С FMNH2 электроны переносятся затем на ряд железо-серных белков (FeS), играющих роль второй простетической группы в молекуле NADH-дегидрогеназы. Атомы железа в этих белках (негемовое железо) собраны в несколько групп, так называемых железо-серных центров. FeS-центры входят в состав многих белков (флавопротеинов, цитохромов), участвующих в окислительно-восстановительных реакциях. Известны 3 типа FeS-центров (FeS, Fe2S2, Fe4S4), в которых атом железа связан с атомом серы остатков цистеина или неорганической серы. NADH-дегидрогеназа содержит несколько центров типа Fe2S2 и Fe4S4 Атомы железа в таких центрах могут принимать и отдавать электроны поочерёдно, переходя в ферро- (Fe2+) и ферри- (Fe3+) состояния. От железо-серных центров электроны переносятся на кофермент Q (убихинон). Обозначение этого жирорастворимого хинона происходит от первой буквы английского названия хинона (quinone), а название убихинон отражает его широкую распространённость в природе (ubiquitous – вездесущий). Молекулы убихинона в зависимости от источника, из которого они выделены, различаются длиной углеводородной цепи, которая у млекопитающих содержит 10 изопреноидных звеньев и обозначается как Q10. В процессе переноса электронов с NADH-дегидрогеназы через FeS на убихинон он обратимо превращается в гидрохинон. Убихинон выполняет коллекторную функцию, присоединяя электроны от NADH-дегидрогеназы и других флавинзависимых дегидрогеназ, в частности, от сукцинат-дегидрогеназы. Убихинон участвует в реакциях типа: Е (FMNH2) + Q → Е (FMN) + QH2. Цитохромы или гемопротеины присутствуют во всех типах организмов. В клетках эукариотов они локализованы в митохондриальных мембранах и в ЭР. Известно около 30 различных цитохромов. Все цитохромы в качестве простетической группы содержат гем . Их многообразие обусловлено:  различием боковых цепей в структуре тема;  различием в структуре полипептидных цепей;  различием в способе связи полипептидных цепей с гемом. В зависимости от способности поглощать свет в определённой части спектра все цитохромы делят на группы а, b, с. Внутри каждой группы отдельные виды с уникальными спектральными свойствами обозначают цифровыми индексами (b, b1, b2 и т.д.). Структурные особенности разных видов цитохромов определяют различие в их окислительно-восстановительных потенциалах. В ЦПЭ участвуют 5 типов цитохромов (а, а3, b, с, с1). За исключением цитохрома с, все цитохромы находятся во внутренней мембране митохондрий в виде сложных белковых комплексов. QН2-дегидрогеназа (коэнзим Q-цитохром с-ре-уктаза, комплекс III) состоит из 2 типов цитохромов (b1 и b2) и цитохрома с1. QН2-дегидрогеназа переносит электроны от убихинола на цитохром с. Внутри комплекса III электроны передаются от цитохромов b на FeS-центры, на цитохром с1, а затем на цитохром с. Группы тема, подобно FeS-центрам, переносят только по одному электрону. Таким образом, от молекулы QH2 2 электрона переносятся на 2 молекулы цитохрома b. В качестве промежуточного продукта в этих реакциях переноса электронов возможно образование свободного радикала се-михинона. В цитохромах типа b гем не связан ковалентно с белком, а в цитохромах с1 и с он присоединяется к белку при помощи тиоэфирных связей. Эти связи образуются путём присоединения 2 цистеиновых остатков к винильным группам гема. Цитохром С – периферический водорастворимый мембранный белок с молекулярной массой 12 500 Д, имеющий одну полипептидную цепь из 100 аминокислотных остатков, и молекулу гема, ковалентно связанную с полипептидом. Цитохромоксидаза (комплекс IV) состоит из 2 цитохромов типа аа3 каждый из которых имеет центр связывания с кислородом. Цитохромы а и а3 имеют характерную железопорфириновую простетическую группу, называемую гемом А и отличающуюся от гема цитохромов с и c1. Он содержит формильную группу вместо одной из метальных групп и углеводородную цепь вместо одной из винильных групп. Другая особенность комплекса а-а3 – наличие в нём ионов меди, связанных с белковой астью в так называемых CuA-центрах. Перенос электронов комплексом а-а3 включает реакции: Cu+ ↔ Cu2+ + e, Fe2+ ↔ Fe3+ + e. Комплекс цитохромов а-а3 непосредственно реагирует с молекулярным кислородом.

В цепь переноса электронов, которая расположена на внутренней мембране митохондрий , входит ряд последовательно расположенных переносчиковэлектронов, которые отличаются способностью акцептировать электроны. Самый сильный акцептор электронов кислород расположен в конце цепи.

14.

Образование молекулы АТР, главного источника энергии для совершения работы в биологических системах, сегодня не может быть описано в терминах точного химического механизма элементарных стадий, однако ясно, что движущей силой процесса служит энергия электрического поля, существующего на внутренней мембране митохондрий. Возникает естественный вопрос: что служит источником этой энергии? В самом общем виде ответ можно сформулировать так. Питательные вещества (белки, жиры и углеводы) в конечном счете превращаются в ограниченный набор низкомолекулярных соединений – органических кислот. Углеродные атомы, из которых построены эти кислоты, окисляются (у аэробных организмов кислородом) до углекислого газа и воды. Процесс окисления органических кислот кислородом происходит в митохондриях – клеточных органеллах, обеспечивающих бЧльшую часть синтеза АТР в клетках. Потребление кислорода в качестве окислителя обычно называют внутриклеточным дыханием. Энергия, освобождающаяся в результате химической реакции окисления, превращается в электрохимическую и в таком виде используется для синтеза АТР.

Трансформация энергии окисления осуществляется ферментами, расположенными во внутренней мембране митохондрий и работающими как генераторы, которые используют в качестве носителя электрического заряда ион водорода (Н+, протон). По определению, окислительными (точнее, окислительно-восстановительными) реакциями называют такие, в которых происходит перенос электронов от молекулы-донора (восстановителя) к молекуле-акцептору (окислителю). Эти реакции чрезвычайно распространены в живых системах и катализируются ферментами, получившими название оксидоредуктаз. Совокупность оксидоредуктаз, катализирующих процесс внутриклеточного дыхания, обычно называют дыхательной цепью. Для ответа на вопрос о том, как возникает электричество в мембране митохондрий, предстоит рассмотреть, как работает дыхательная цепь.

Отметим сразу, что для возникновения электрического поля (одна сторона мембраны заряжена положительно, а другая – отрицательно) необходимо, чтобы ферменты дыхательной цепи осуществляли векторный, направленный (по отношению к сторонам мембраны) перенос электронов от восстановителя к окислителю. В этом состоит принципиальное отличие работы оксидоредуктаз дыхательной цепи от функционирования ферментов, катализирующих аналогичные реакции в гомогенном (изотропном) растворе, где вопрос о направлении реакции в пространстве не имеет смысла (скалярные процессы).

ИСТОРИЯ ПРОБЛЕМЫ

Началом изучения дыхания принято считать классические опыты Антуана Лавуазье (A. Lavoisier), который еще в 1777 году показал, что “чистый воздух, войдя в легкие, выходит из них частично в виде связываемого воздуха или меловой кислоты. Следовательно, чистый воздух, проходя через легкие, претерпевает такое разложение, которое имеет место при горении угля”. То, что Лавуазье назвал меловой кислотой, было, как мы теперь знаем, углекислым газом (CO2). Начало современным представлениям о внутриклеточном дыхании было положено работами В.И. Палладина в России (1909 год), Т. Тунберга (T. Thunberg) в Швеции (1909 год), Г. Виланда (H. Wieland) и О. Варбурга (O. Warburg) в Германии, выполненными в 20-х годах нынешнего века. К тому времени уже было известно, что ткани млекопитающих катализируют окисление органических кислот кислородом воздуха. При обсуждении механизма этого катализа к середине 20-х годов сформировались две на первый взгляд альтернативные точки зрения. Т. Тунберг и Г. Виланд полагали, что быстрое окисление химически инертных органических кислот связано с существованием в тканях ферментов (дегидрогеназ) – активаторов атомов водорода в молекулах субстратов. О. Варбург считал, что катализ обусловлен железосодержащим ферментом, названным им дыхательным ферментом, активирующим химически инертный кислород. Как часто случается, оказалось, что обе точки зрения верны. Примерно в то же время Д. Кейлин (D. Keilin) в Кембридже обнаружил существование в тканях пигментов, названных им цитохромами, окраска которых зависела от наличия кислорода и активности дыхательного фермента Варбурга. Кейлин предположил, а потом элегантными опытами доказал, что цитохромы являются связующим звеном между дегидрогеназами Тунберга и Виланда и дыхательным ферментом Варбурга. Позднее Кейлин и его ученики доказали, что существуют несколько цитохромов, различающихся по своей окраске и все они являются обязательными компонентами почти любых живых систем (Кейлин обследовал более 100 различных видов животных и растений). К середине 30-х годов стало ясно, что окисление органических кислот (SH2) кислородом в тканях может быть описано следующей схемой:

К середине 50-х годов выяснилось, что некоторые дегидрогеназы, цитохромы Кейлина и дыхательный фермент Варбурга (дыхательная цепь) прочно связаны с внутренними мембранами митохондрий. В 60-х годах Д. Грин (D. Green) с сотрудниками в США разработал методы разделения, выделения и очистки компонентов дыхательной цепи. Уже к концу 30-х годов благодаря работам В.А. Энгельгардта, В.А. Белицера и Г. Калькара (H. Kalckar) была установлена тесная связь между процессами окисления (поглощение кислорода) и образования АТР (фосфорилирование). Природа этой связи (сопряжение двух процессов), обеспечивающей главный суммарный процесс биоэнергетики – окислительное фосфорилирование, оставалась загадкой вплоть до 60-х годов, когда П. Митчелл (P. Mitchell) опубликовал гипотезу о хемиосмотическом сопряжении, ставшую спустя примерно двадцать лет общепринятой теорией.

ДЫХАТЕЛЬНАЯ ЦЕПЬ И ЕЕ КОМПОНЕНТЫ

Рассмотрим более детально устройство отдельных блоков схемы, изображенной выше. Прежде чем это сделать, необходимы несколько предварительных замечаний. До сих пор при описании процесса внутриклеточного дыхания говорилось, что кислород расходуется на окисление ограниченного числа органических соединений, образующихся из продуктов питания. В живых системах наиболее распространены следующие химические группировки, подвергающиеся окислению:

Во всех приведенных примерах окисление можно рассматривать как отщепление двух атомов водорода, каждый из которых состоит из протона и электрона. Протон в водном растворе существует в виде катиона Н+, и, если на время забыть об электронах, каждая из приведенных выше реакций будет сопровождаться закислением среды. Электроны в свободном виде в водном растворе существовать не могут, поэтому для протекания этих реакций белки-катализаторы должны содержать ловушку для электронов. В качестве такой ловушки в ферментах-дегидрогеназах служат относительно небольшие (по сравнению с размером белков) органические или неорганические молекулы или атомы разной химической природы. Эти молекулы принято называть кофакторами или простетическими группами. Таким образом, любой белок, катализирующий окислительно-восстановительную реакцию, содержит кофактор, способный к обратимому окислительно-восстановительному превращению. Есть и другая, не менее важная роль кофакторов. Если в клетке в свободном, не связанном с белком состоянии присутствует какая-либо молекула кофактора в достаточном количестве, то атомы водорода, отщепляющиеся от органических молекул в результате действия дегидрогеназ, могут быть запасены в виде восстановленной формы кофактора. Это достигается либо заменой восстановленной формы связанного с ферментом кофактора на его окисленную форму, либо окислением связанного кофактора свободным. Существуют несколько типов свободных кофакторов. В качестве основного служит молекула достаточно сложного химического строения, носящая, согласно принятой биохимиками номенклатуре, название никотинамидадениндинуклеотид (сокращенно NAD), окисленная форма которого показана ниже:

Коллектором атомов водорода (протонов и электронов) в молекуле NAD+ служит только небольшая ее часть:

В процессе восстановления исходно окисленная молекула NAD (обозначают NAD+, по заряду участвующей в реакции группы) принимает два электрона и один протон. В грубом приближении можно считать, что все окислительные реакции, катализируемые дегидрогеназами, приводят к универсализации отщепленных атомов водорода и запасанию их в виде NADН. NAD+ и NADН хорошо растворимы в воде и присутствуют в значительных количествах в цитоплазме и митохондриях. Дыхательная цепь, состоящая из нескольких ферментов, прочно связанных с внутренней мембраной митохондрий, осуществляет окисление митохондриального NADН кислородом:

В присутствии кислорода два электрона в молекуле NADН стремятся перейти к молекуле кислорода, и такой переход сопровождается освобождением энергии. Восстановленная форма NADН устойчива и без ферментов не окисляется кислородом. “Водород” (два электрона и протон) в молекуле NADН так же химически устойчив, как химически инертен газообразный водород (Н2) в смеси с газообразным кислородом (О2). Такая смесь, однако, известна под названием “гремучий газ”, и достаточно искры, чтобы произошел взрыв – мгновенное образование воды, сопровождающееся огромным выделением энергии в виде тепла. Задача, стоящая перед ферментами дыхательной цепи, такова: необходимо провести взрыв так, чтобы освобождающаяся энергия была запасена в форме, пригодной для совершения работы – синтеза АТР. Уместно подчеркнуть, что ферменты дыхательной цепи замечательны не столько тем, что они, как и всякие другие катализаторы, увеличивают скорость химической реакции (многие окислительно-восстановительные реакции мгновенно протекают в водных растворах и без ферментов), сколько тем, что они упорядоченно переносят электроны от одного компонента к другому (в конечном счете на кислород), постепенно понижая потенциал “водорода” и запасая энергию.

Проследим теперь путь двух электронов от NADН к кислороду, оставляя пока в стороне энергетику этого процесса. Суммарный процесс разбит на три стадии, каждая из которых катализируется тремя липопротеидными комплексами, встроенными во внутреннюю мембрану митохондрий. Каждый комплекс (I, III и IV) представляет собой весьма крупное образование, построенное из многих полипептидных цепей. Комплекс I, например, состоит из более чем 40 таких цепей (субъединиц) и имеет молекулярную массу около 1 млн. Комплексы плавают в фосфолипидном море мембраны, так что верхушки и дно этих айсбергов контактируют с водными фазами матрикса и межмембранного пространства митохондрий (рис. 1). Жидкая липидная фаза разрешает двумерную диффузию комплексов в плоскости мембраны, так что комплексы могут встречаться между собой. Каждый комплекс катализирует окислительно-восстановительную реакцию – перенос электронов и, следовательно, как уже отмечалось, содержит в своем составе простетические группы, способные принимать и отдавать электроны. Эти группы представлены разнообразным набором химических структур. Комплекс I содержит в своем составе флавин (производное витамина рибофлавина) и более 20 атомов железа, упакованных в клетки, построенные из атомов серы. Комплекс III содержит железо как в серных клетках, так и в виде комплексов с порфиринами – сложными гетероциклическими молекулами, содержащими четыре атома азота. Такие комплексы называются гемами, а комплексы гемов с полипептидными цепями – цитохромами. В состав комплекса IV (дыхательный фермент Варбурга, цитохромоксидаза) помимо двух различных гемов входят несколько атомов меди, прочно связанных с белком. Кроме этих трех гигантских образований в состав дыхательной цепи входят еще два компонента. Один из них – небольшой белок (молекулярная масса около 13 тыс.), содержащий ковалентно связанный гем – цитохром с. Другой – нерастворимое в воде “жирное” соединение – убихинон, способное выполнять в гидрофобной фазе мембраны такую же функцию, какую выполняет NAD в водном окружении цитоплазмы или матрикса митохондрий, – запасать атомы водорода:

Убихинон (как окисленный, так и восстановленный) совершенно нерастворим в воде, но хорошо растворяется в средах с низкой диэлектрической постоянной (“жирные” среды). Длинный хвост убихинона, по-видимому, вытянут в плоскости гидрофобного слоя мембраны, а активная голова может располагаться либо в той же плоскости, либо приближаться к поверхностям мембраны, контактирующим с водными фазами. Важное свойство убихинона, которое понадобится нам при дальнейшем рассмотрении, состоит в том, что его голова может восстанавливаться ступенчато, принимая последовательно по одному электрону (и протону). При этом возникает полувосстановленная форма – убисемихинон.

Первая стадия окисления NADН катализируется комплексом I, один активный центр которого контактирует с водной фазой матрикса (внутреннее пространство митохондрий) и связывает NADH. Два электрона, отщепленные от NADН, путешествуют по окислительно-восстановительным компонентам комплекса I и в конечном счете попадают на убихинон, который связывается с другим активным центром, расположенным внутри гидрофобной фазы мембраны. В результате происходит реакция

NADH + H+ + Убихинон

NAD+ + Убихинол,

в ходе которой электроны из водного окружения (в молекуле NADН) попадают в “жирную” фазу мембраны (молекула убихинола). Энергетический потенциал (запас энергии) атомов водорода (Н+ + ) в молекуле убихинола существенно ниже, чем в молекуле NADН, и в результате реакции освобождается энергия. Если бы такой процесс проходил в гомогенном растворе (независимо от того, катализировался бы он комплексом I или спонтанно), то энергия выделилась бы в виде тепла. На самом деле энергия реакции запасается, но об этом позже.

Восстановленный убихинон (убихинол) отдает электроны из гидрофобной фазы в водное окружение – на атом железа гема цитохрома с. Этот процесс катализируется комплексом III (при этом электроны путешествуют по атомам железа в составе компонентов комплекса):

Убихинол + 2 цитохром с

(железо окислено)

Убихинон + 2 цитохром с + 2Н+

(железо восстановлено)

Энергетический потенциал электронов (теперь в цитохроме с) становится еще ниже. Окисленный цитохром с хорошо связывается с комплексом III, а восстановленный – с комплексом IV. Это означает, что комплексы III и IV умеют различать белковые молекулы окисленного и восстановленного цитохрома с (молекулярная масса около 13 тыс.), отличающиеся друг от друга всего на один электрон, – яркий пример того, что связывание малого по размеру лиганда (в данном случае электрона) способно приводить к изменению конформации белка!

Последняя стадия (теперь в реакцию дыхания вступает собственно кислород) катализируется комплексом IV:

4 цитохром с + О2 + 4Н+ +

(железо восстановлено)

4 цитохром с + Н2О,

(железо окислено)

и электроны, пройдя по атомам железа и меди в составе комплекса IV, попадают, наконец, на кислород, связывающийся в активном центре цитохромоксидазы, что приводит к образованию воды.

Суммарная реакция, катализируемая дыхательной цепью, таким образом состоит в окислении NADH кислородом, приводящем к образованию Н2О. Энергетический потенциал электронов в NADH, который по запасу энергии существенно больше, чем даже в молекуле водорода, оказывается плавно спущенным до стабильного состояния в молекуле воды. При этом освобождается энергия, достаточная для синтеза по крайней мере трех молекул АТР на каждую пару электронов, перенесенных от NADH к кислороду.

ХЕМИОСМОТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ

ЗАПАСАНИЯ ЭНЕРГИИ ДЫХАНИЯ

Читатель наверняка обратил внимание на то, что при рассмотрении окислительно-восстановительных реакций (собственно обмен электронами) в уравнениях, описывающих эти реакции, постоянно фигурировала другая заряженная частица – ион водорода, протон (Н+). Этот знаменательный факт, как оказалось, имеет принципиальное значение для понимания сопряжения между окислительно-восстановительными реакциями и запасанием освобождающейся при этом энергии. На возможность создавать высокие концентрации ионов Н+ в клетках при протекании реакции окисления впервые, по-видимому, обратили внимание в 50-х годах Р. Дэвис (R. Davies), А. Огстон (A. Ogston) и Ю. Конвей (E. Konway) при обсуждении вопроса о механизме секреции кислоты клетками желудка. Если представить себе, что реакции, о которых шла речь, протекают так, что электроны удаляются из раствора, окисление любой органической молекулы приведет к появлению в этом растворе ионов водорода (рН раствора понизится, повысится кислотность раствора). П. Митчелл в 1961 году предложил идею хемиосмотического энергетического сопряжения в дыхательной цепи. Пожалуй, наиболее существенны для понимания принципа хемиосмотического сопряжения следующие положения.

1. Внутренняя мембрана митохондрий, где происходят окислительно-восстановительные реакции дыхания, непроницаема для ионов водорода (Н+) (точнее, протон диффундирует через двойной фосфолипидный слой очень медленно по сравнению со скоростью потребления кислорода). В то же время мембраны хорошо проницаемы для воды и благодаря электролитической диссоциации Н2О Н+ + + ОН- запас протонов в водных растворах неограничен.

2. Внутренняя мембрана митохондрий асимметрична: одни компоненты дыхательной цепи контактируют с матриксом (например, активный центр комплекса I), другие расположены внутри мембраны (например, убихинон), третьи контактируют с межмембранным пространством (например, цитохром с).

3. Разрушение мембраны не препятствует окислению NADH кислородом, а даже ускоряет дыхание. Энергетическое сопряжение (синтез АТР) при этом полностью прекращается: происходит разобщение процессов переноса электронов и запасания энергии. Для разобщения необязательно полностью разрушать мембрану – достаточно, сохраняя ее структуру, добавить вещества, резко повышающие проницаемость мембраны для протона.

Для того чтобы понять принцип хемиосмотического сопряжения, предложенный Митчеллом, воспользуемся рассмотрением химического генератора электричества, применяющегося в технике. Представим себе сосуд, разделенный перегородкой, проницаемой для воды и непроницаемой для каких бы то ни было ионов (рис. 2). В перегородку вмонтирован проводник электричества – металл (М), торцовые поверхности которого, обращенные одна в левый, а другая в правый отсек сосуда, покрыты каким-нибудь химическим катализатором (мелко диспергированная платина, никель). Осуществим теперь подачу к левой поверхности металлического проводника водорода (Н2), а к правой кислорода (О2). Ситуация аналогична той, которая создается в гремучем газе (смеси кислорода и водорода), однако между реагирующими молекулами возможен только электронный контакт (за счет металлического проводника). В результате теплового движения и действия катализатора на левой поверхности проводника будет происходить реакция Н2 2Н+ + + Протоны (2Н+) останутся в растворе (перегородка непроницаема для ионов). Электроны отправятся по проводнику к правой поверхности, где при встрече с активированным на правой поверхности кислородом произойдет реакция

Суммарный процесс такого контролируемого окисления водорода кислородом (образование воды) приведет к тому, что перегородка окажется электрически заряженной (два отрицательных заряда слева перенесены направо) и возникнет разница концентраций ионов водорода в обоих отсеках ячейки: слева появится кислота (Н+), а справа – щелочь (ОН-)

Первый член правой части равенства, описывающего энергетический баланс реакции (DY), – электрическая составляющая запасенной энергии, второй – осмотическая. Очевидно, что, после того как перегородка зарядится (слева +, справа -), процесс прекратится – электроны не побегут по проводнику против электрического поля. Если заряд на перегородке снимать (подключить устройство, потребляющее электрическую энергию, например лампочку), то окисление продолжится, а горение лампочки будет сопровождаться накоплением кислоты слева и щелочи справа. Можно расходовать запасенную энергию и по-другому: устроить в перегородке каналы для протонов. В этом случае за счет тока протонов слева направо также можно будет совершать работу. Именно так (за счет тока протонов) устроена молекулярная машина, синтезирующая АТР.

КОМПОНЕНТЫ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ – ТРАНСЛОКАТОРЫ ПРОТОНОВ

Каждый из трех комплексов, составляющих дыхательную цепь, работает так, что перенос электронов по его компонентам – простетическим группам – сопровождается переносом протонов через сопрягающую мембрану. Возникает вопрос: как хемиосмотический принцип сопряжения реализован в белковых конструкциях комплексов дыхательной цепи? В принципе возможны два варианта таких конструкций. Первый, в качестве гипотезы предложенный П. Митчеллом получил название окислительно-восстановительной петли. Схематически такой механизм изображен на рис. 3. Легко видеть, что этот механизм аналогичен тому, который мы рассмотрели применительно к топливному элементу. Роль металлического проводника выполняют простетические группы комплекса (Y1 , Y2 и Y3), а поверхностей, покрытых катализатором, – его активные центры. Вся система организована в пространстве в виде петли, так что электроны дважды пересекают мембрану: один раз вместе с протонами, а другой – сами по себе.

Отметим, что для возникновения по механизму петли необходимо, чтобы дыхательный комплекс имел в своем составе компоненты, способные переносить Н (см. верхнюю часть петли). Анализ качественного состава переносчиков электронов в комплексах, однако, показал, что это не всегда выполняется. Так, например, атомы железа при изменении валентности могут переносить электроны, но неспособны быть носителями протонов. В связи с этим, развивая идеи Митчелла, несколько исследовательских групп предложили вариант функционирования комплексов в качестве генераторов который можно назвать протонным насосом. Принципиальная схема такого насоса показана на рис. 4. В такой модели комбинация пар А, Х и В, Y фактически служит в качестве переносчиков атома Н. Для направленного переноса Н+ справа налево протонный насос, очевидно, должен быть снабжен клапанами, не позволяющими протону возвращаться назад в матрикс при окислении, например, группы Х. Принимая во внимание конформационную подвижность белков, сконструировать такой клапан достаточно легко. По-видимому, обе модели – петля и протонный насос – и их вариации реализуются при функционировании дыхательных комплексов.

МЕХАНИЗМ РАБОТЫ КОМПЛЕКСА III

До сих пор мы обсуждали принципы устройства генераторов электричества в дыхательной цепи. Теперь можно рассмотреть работу одного из них более детально на конкретном примере комплекса III, механизм функционирования которого на сегодня изучен лучше всего. Донором электронов для этого комплекса служит восстановленный убихинон (QH2), а акцептором – цитохром с. Напомним, что убихинон служит переносчиком атомов водорода, а цитохром с, содержащий в качестве простетической группы атом железа в составе гема, может принимать и отдавать только электроны.

Комплекс III (рис. 5) представлен липопротеидом, состоящим из нескольких различных полипептидных цепей. В качестве переносчиков электронов комплекс содержит негемовые атомы железа (Fe-S), атом железа в составе гема цитохрома с1 и два атома железа в составе еще двух различных гемов b(I) и b(II). Активный центр цитохрома с1 расположен на внешней, обращенной в межмембранное пространство стороне внутренней мембраны митохондрий (там, где находится цитохром с). Последовательность реакций, приводящих к возникновению электричества при работе комплекса III, показана на рис. 5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Можно с уверенностью сказать, что принципиальное устройство трансформаторов энергии – компонентов дыхательной цепи стало ясным. Более того, принцип хемиосмотического сопряжения Митчелла, как оказалось, работает не только в митохондриях, но при функционировании и других биологических трансформаторов энергии, таких, как, например, светопоглощающие комплексы бактерий и растений, анаэробные дыхательные цепи. Это, конечно, не означает, что проблемы трансформации энергии окислительно-восстановительных реакций в энергию решены. Даже для наиболее изученных систем остаются вопросы, на которые пока нет ответа. Почему, например, комплексы дыхательной цепи такие большие и построены из десятков индивидуальных полипептидных цепей, ведь собственно реакционные центры, переносящие электроны, представлены сравнительно малыми по размеру молекулами. Скорее всего, белковое окружение необходимо для точной настройки сродства к электрону каждого центра и тем самым для обеспечения строгой упорядоченности процесса. Упорядоченность, по-видимому, достигается и структурным расположением переносчиков электронов внутри и на поверхности белковых глобул. Поразительные успехи рентгеноструктурного анализа белков позволили увидеть полные пространственные структуры комплекса IV (дыхательного фермента Варбурга, состоящего из 13 различных полипептидных цепей). В самое последнее время удалось расшифровать и структуру комплекса III. Почти ничего не известно о механизме генерации “электричества” комплексом I.

Исторически сложилось так, что в течение более чем полувека биохимики и биофизики стремились установить последовательность и выяснить физико-химические закономерности переноса электронов в дыхательной цепи. Опыт изучения других полиферментных систем показывает, что биология начинается тогда, когда перед исследователями встают вопросы о регулировании процессов. Этот аспект понимания внутриклеточного дыхания только начинает развиваться, и можно с уверенностью сказать, что на этом пути нас ожидают увлекательные открытия.

Окислительное фосфорилирование

Предыдущая25262728293031323334353637383940Следующая

Синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата, сопряженный с переносом протонов и электронов по дыхательной цепи от субстратов к кислороду, называется окислительным фосфорилированием.

Для количественного выражения окислительного фосфорилирования введен коэффициент окислительного фосфорилирования, который представляет собой отношение числа молекул неорганического фосфата, перешедших в состав АТФ в процессе дыхания, на каждый поглощенный атом кислорода. Отношение Р/О для полной дыхательной цепи равно 3, для укороченной – 2.

Энергия окисления, достаточная для образования молекулы АТФ выделяется в ЦПЭ в следующих стадиях: 1) НАД – ФМН (НАДН-дегидрогеназа); 2) цит b – цит с (убихинол- цитохром с редуктаза); 3) цит а – 1/2 О₂ (цитохром с-оксидаза). На этих стадиях изменения ОВП превышают 0,22 В, что достаточно для образования макроэргической связи АТФ (>30,2 кДж/моль). Уменьшение свободной энергии, сопровождающее перенос протонов и электронов на кислород в результате одного дегидрирования, составляет примерно 220 кДж/моль. При этом на синтез АТФ в полной дыхательной цепи может быть израсходовано 30,2×3=90,6 кДж/моль. Отсюда КПД ЦПЭ около 40%. Остальная энергия рассеивается в виде тепла (поддержание температуры тела).

Известны три основных гипотезы окислительного фосфорилирования.

1. Механохимическая, или конформационная (Грин, Бойер, 60-е гг. ХХ в.). В процессе переноса протонов и электронов изменяется Конформация белков-ферментов. Они переходят в новое богатое энергией состояние, а затем при возвращении в исходную конформацию отдают энергию для синтеза АТФ. Гипотеза частично подтверждена: Еокисл.→ Еконформ. сдвигов → Е_АТФ.

2. Гипотеза химического сопряжения (Липман, Слейтер, Ленинджер, 30-40-е гг. ХХ в.). В сопряжении дыхания и фосфорилирования участвуют сопрягающие вещества, например вещество Х. Вещество «Х» акцептирует протоны и электроны от первого фермента в пункте сопряжения, взаимодействует с Н₃РО₄. В момент отдачи протонов и электронов второму ферменту пункта сопряжения связь становится макроэргической. Далее макроэрг передается на АДФ с образованием АТФ. До настоящего времени не выделены сопрягающие вещества.

3. Хемиосмотическая гипотеза П.Митчелла (1961). По современным представлениям дыхание и фосфорилирование связаны между собой электрохимическим потенциалом (ЭХП) на внутренней мембране митохондрий. Для объяснения необходимы следующие понятия: а) внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для Н⁺ и ОН^–; б) во внутреннюю мембрану митохондрий вмонтирована АТФ-синтаза, катализирующая обратимую реакцию: АТФ + Н₂О « АДФ + Рн. АТФ-синтаза состоит из следующих субъединиц: F₀ – гидрофобный сегмент из 13 полипептидных цепей, связанный с внутренней мембраной митохондрий; F₀ – это протонный канал, по которому в норме только могут перемещаться протоны через мембрану; F₁ – сопрягающий фактор, катализирующий синтез АТФ при перемещении протонов. В укороченной цепи переноса электронов отсутствует только первый этап, остальной перенос электронов такой же, как и в полной цепи; в) синтез АТФ осуществляется при перемещении протонов через АТФ-синтазу в направлении от ММП (межмембранное пространство) к матриксу.

Суть окислительного фосфорилирования: за счет энергии переноса электронов в ЦПЭ (Е_{окисления}) происходит движение протонов через мембрану в ММП и создается электрохимический потенциал (Е_ЭХП). При возвращении протонов назад через АТФ-синтазу энергия ЭХП трансформируется в энергию АТФ – Е_АТФ. Итак: Е_Окисл. ® Е_ЭХП ® Е_АТФ.

НАДН-КоQ редуктаза, цитохром редуктаза и цитохромоксидаза выталкивают протоны в межмембранное пространство. Протоны берутся из Н₂О матрикса или за счет конформационных изменений в ферментах. Со стороны матрикса на мембране будет преобладать отрицательный заряд (избыток ОН^–), а со стороны ММП положительный (за счет Н⁺). Возникает ЭХП, который состоит из двух компонентов: осмотического (разности концентраций ионов Н⁺) и электрического (разности электрических потенциалов):ΔmН⁺ = Dj + DрН. Эта величина измерена, она равна ~0,25 В (хемиосмотическая гипотеза П.Митчела). При обратном токе протонов через канал АТФ-синтазы (разрядка мембраны) возникает 3 молекулы АТФ в полной ЦПЭ и 2 молекулы АТФ в укороченной. Таким образом внутренняя мембрана митохондрий выполняет роль сопрягающей мембраны. Теперь можно суммировать все строение ЦПЭ в виде 5 ферментативных комплексов, привязав их положение к шкале ОВП (таблица 6.3).

Таблица 6.3

Компоненты митохондриальной цепи переноса протонов и электронов

Полная ЦПЭ – 1,3,4 и 5 комплексы, укороченная ЦПЭ – 2,3,4 и 5 комплексы.

В англоязычной литературе указывается, что на каждую пару электронов, переносимых от НАДН в межмембранное пространство выталкивается 10 протонов, а при окислении сукцината – 6 протонов. В результате проведенных исследований установлено, что для синтеза 1 молекулы АТФ необходимо 4 протона, 3 из которых используется для образования АТФ, а 1 протон используется для транспорта Рн, АТФ и АДФ через митохондриальную мембрану. Следовательно, если 10 протонов выталкивается в межмембранное пространство, а 4 используется для синтеза АТФ, то коэффициент окислительного фосфорилирования равен 2,5 (10/4) в полной дыхательной цепи и 1,5 (6/4) в укороченной дыхательной цепи. Однако, окончательный вывод можно будет сделать только при полной расшифровке механизма функционирования АТФ-азы.

У некоторых морских бактерий возникновение электрохимического потенциала на мембране связано с возникновением ΔmNa, что определяет синтез АТФ, создание солевых градиентов и движение жгутиков.

Дыхательный контроль – это регуляция скорости переноса электронов по дыхательной цепи отношением АТФ/АДФ. Чем меньше это отношение (преобладает АДФ), тем интенсивнее идет дыхание (это обеспечивает реакцию АДФ + Рн ® АТФ). Это видно по увеличению потребления кислорода митохондриями после добавки АДФ (эксперименты Чанса) или по усиленному дыханию бегущего человека.

Вещества, прекращающие поток электронов по дыхательной цепи ферментов, называют ингибиторами дыхания. Ротенон и амитал специфически ингибируют перенос электронов в НАДН-дегидрогеназном комплексе и таким образом предотвращают генерирование протонного градиента в 1-м комплексе. В то же время указанные ингибиторы не нарушают окисление сукцината. Антимицин А тормозит ток электронов между цитохромами b и c₁, предотвращая синтез АТФ, сопряженный с генерированием протонного градиента в 3-м комплексе. Этот блок можно обойти добавлением аскорбата, который непосредственно восстанавливает цитохром с. Наконец, ток электронов может быть блокирован между цитохромоксидазным комплексом и кислородом под действием CN^–, N₃^– и СО. В присутствии этих ингибиторов из-за блокирования тока электронов не происходит фосфорилирования, сопряженного с генерированием протонного градиента в 4-м комплексе.

Разобщение дыхания и окислительного фосфорирования возникает при повышении проницаемости мембраны митохондрий для протонов в любом месте, а не только в канале АТФ-синтазы. При этом не создается электрохимический потенциал и энергия окисления рассеивается в виде тепла. Так действуют ионофоры (2,4-динитрофенол, валиномицин и др.). Они переносят обратно протоны через мембрану, выравнивая градиенты рН и мембранного потенциала. Лекарственные препараты (аминобарбитал), продукты жизнедеятельности микроорганизмов, избыток тиреоидных гормонов (вызывают накопление ненасыщенных жирных кислот, являющихся ионофорами) и др. приводят к разобщению дыхания и фосфорилирования, обеспечивая гипертермию.

На разобщении дыхания и фосфорилирования базируется терморегуляторная функция тканевого дыхания. Тканевое дыхание, протекающее в митохондриях и не сопровождающееся образованием макроэргов, называют свободным или нефосфорилирующим окислением.

Природным разобщающим агентом является термогенин, протонный канал в митохондриях бурых жировых клеток. Бурый жир обнаружен у новорожденных и животных, впадающих в зимнюю спячку и служит для теплообразования. При охлаждении организма норадреналин активирует гормонзависимую липазу. Благодаря активному липолизу в организме образуется большое количество свободных жирных кислот, которые распадаются в результате β-окисления и в дыхательной цепи. Так как жирные кислоты одновременно открывают протонный канал термогенина, их распад не зависит от наличия АДФ, т.е. протекает с максимальной скоростью и генерирует энергию в форме тепла.

Образованная в результате окислительного фосфорилирования в митохондриях АТФ обменивается на внемитохондриальную АДФ с помощью специальных белков транслоказ (транслоказы составляют до 6% от всех белков внутренней мембраны митохондрий).

Гипоэнергетические состояния возникают 1) при нарушении поступления субстратов для дегидрирования (на всех этапах от пищи до матрикса митохондрий); 2) при нарушении поступления О₂ в митохондрии (на всех этапах от дыхания, связь с кислорода с гемоглобином, транспорт и пр.); 3) при нарушении мембран митохондрий, композиции липидного бислоя и ферментативных ансамблей внутренней мембраны митохондрий. Предложено вычислять энергетическое состояние клетки, вычисляя «заполнение» системы АТФ-АДФ-АМФ макроэргами. Если все три компонента представлены АТФ, то система энергетически полностью заполнена и ее энергетический заряд равен 1,0. Если же система представлена только АМФ, то ее энергетический заряд равен 0.

Энергетический заряд клетки является важной величиной, определяющей соотношение катаболических и анаболических процессов в ней. В тканях животных важную регуляторную роль выполняет величина отношения АТФ/АДФ.

В сутки человек потребляет в среднем 27 моль кислорода. Основное его количество (примерно 25 моль) используется в митохондриях в ЦПЭ. Следовательно, ежесуточно синтезируется 125 моль АТФ, или 62 кг (при расчете использован коэффициент Р/О = 2,5, т.е. среднее значение коэффициента фосфорилирования). Масса всей АТФ, содержащейся в организме, составляет примерно 20-30 г. Следовательно, каждая молекула АТФ за сутки 2500 раз проходит процесс гидролиза и синтеза.

Молекулярные моторы – это ферменты, трансформирующие химическую энергию гидролиза АТФ в механическую работу (Schliwa M., 2006). В эукариотических клетках выделяют три различных класса моторов: 1) миозин; 2) кинезин и 3) динеин. Для них характерны: 1) протяженная полярная структура, вдоль которой в одном направлении перемещаются актиновые филаменты (миозин) или микротрубочки (кинезины и динеины); 2) молекулярная организация взаимодействующих субъединиц должна обеспечивать однонаправленное движение; 3) связывающие центры для АТФ и подвижных элементов локализуются в глобулярных каталитических доменах, называемых головками; 3) энергию для движения получается при гидролизе АТФ и реализуется через конформационные изменения белков (поворот головки); 5) взаимодействие субъединиц молекулярных моторов обеспечивает перемещение структур в вязкой цитоплазме. В настоящее время известны 18 классов миозинов (мышцы и др. ткани), 10 семейств кинезинов (цитозоль клеток) и 2 группы динеинов (плазма крови). Три типа моторов различаются по молекулярной массе: кинезины – 45 кДа, миозины – 100 кДа и динеины – 500 кДа. По структуре близки кинезины и миозины. Молекулярные моторы используются различными живыми организмами для клеточной активности – контракция, транспорт органелл, подвижность клеток, клеточное деление, передача информации, процессы развития и др.