Иммунологическое исследование крови

Иммунологическое исследование крови

Ухудшение экологической обстановки и социальноэкономические условия, сопровождающиеся длительной стрессовой ситуацией, приводят к снижению иммунореактивности населения, увеличению частоты развития вторичных иммунодефицитных состояний. Снижение pезистентности организма, употребление ЛС с иммунодепpессиpующим эффектом, pецидивиpующая хроническая вирусная инфекция способствуют развитию вялотекущих воспалительных и дистpофических процессов в половых органах женщины. Нарушения в иммунной системе — важное звено в патогенезе эндометриоза, а также в возникновении и пролиферации новообразований у женщин с бесплодием неясного генеза, наличием антиспеpмальных АТ, АФС, острыми и хроническими воспалительными заболеваниями.

Местные и системные изменения иммунитета можно выявить при иммунологическом исследовании крови с использованием основных традиционных и современных методов. Иммунологические методы необходимы для создания новых диагностических и лечебных технологий, включающих патогенетически обоснованную индивидуально подобранную иммунотерапию с учётом особенностей иммунной системы конкретного пациента. Своевременная правильная диагностика иммунологических нарушений, позволяющая провести их коррекцию, позволяет снизить дозы и длительность применения антибиотиков, предупредить возникновение аллергических реакций.

Основные параметры иммунного статуса (табл. 6-3, табл. 6-4) — количество и активность циркулирующих лимфоцитов, естественных киллеров и фагоцитирующих клеток, концентрация сывороточных иммуноглобулинов, содержание специфических АТ. Иммунологические методы позволяют охарактеризовать тот иммунологический фон, на котором развивается большинство гинекологических и акушерских заболеваний, и позволяет контролировать эффективность лечения, в первую очередь иммуномодулирующими препаратами.

Таблица 6-3. Основные показатели иммунного статуса

Таблица 6-4. Основные показатели иммунного статуса

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

СИНОНИМЫ

Субпопуляционный анализ лимфоцитов крови, фенотипическая характеристика лимфоцитов.

ОБОСНОВАНИЕ

Подразделение лимфоцитов человека на Тлимфоциты, Влимфоциты и естественные киллеры основано на их биологических функциях и на экспрессии ими поверхностных клеточных Аг, определение уровня которой называется фенотипированием. В основе метода лежит связывание флюоресцентно меченых моноклональных АТ поверхностными Аг лимфоцитов и учёт результатов с помощью проточного лазерного цитометра или люминесцентной микроскопии.

ЦЕЛЬ

Подсчёт клеток определённой популяции, или спектра Аг, экспрессированных на данных клетках.

ПОКАЗАНИЯ

Метод используют для количественной и качественной характеристики субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при наличии или подозрении на наличие иммунодефицитных состояний, развившихся на фоне воспалительных, гиперпластических и других процессов в органах женской репродуктивной системы.

ПОДГОТОВКА

Из вены пациентки берут кровь в пробирку с гепарином (20 Ед/мл).

МЕТОДИКА

Кровь обрабатывают лизирующим раствором для разрушения эритроцитов или с помощью градиентного центрифугирования выделяют фракцию мононуклеарных клеток. Суспензию клеток инкубируют в темноте 15–30 мин с соответствующими флюоресцентно мечеными моноклональными АТ. Результаты регистрируют на проточном цитометре или с помощью люминесцентного микроскопа в течение не более 6 ч. Лимфоциты, фиксированные 1% параформальдегидом, можно хранить при +2–8 °С не более 24 ч.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Анализ позволяет оценить количество лимфоцитов в субпопуляции, результаты сопоставляют с нормативными показателями, рассчитывают соотношение Тхелперов и Тцитотоксических лимфоцитов (иммунорегуляторный индекс), содержание активированных Тлимфоцитов и др. Определение процентного соотношения Тлимфоцитов, Влимфоцитов и NKклеток используют для характеристики иммунодефицитных и аутоиммунных состояний, опухолевых и вирусных заболеваний. Фенотипирование лимфоцитов применяют для подтверждения диагноза и мониторинга состояния иммунной системы пациентки в процессе лечения. Чувствительность и специфичность метода зависит от качества используемых реагентов.

ФАКТОР, ВЛИЯЮЩИЙ НА РЕЗУЛЬТАТ

Результат зависит от времени, прошедшего с момента взятия крови. Необходимо проводить исследование в течение 6 ч после взятия крови с гепарином, при фиксации клеток — в течение 24 ч.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ МЕТОД

Используемый ранее метод розеткообразования с эритроцитами не считают современным.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОСНОВНЫХ КЛАССОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МЕТОДОМ PАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ

СИНОНИМЫ

Определение содержания иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) по Манчини.

ОБОСНОВАНИЕ

Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов — один из основных тестов в оценке гуморального звена иммунитета. Концентрация сывороточных иммуноглобулинов отражает функциональное состояние Вклеточного звена иммунитета.

ЦЕЛЬ

Оценка содержания основных классов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) в сыворотке крови.

ПОКАЗАНИЯ

Метод используют для оценки состояния гуморального звена иммунитета, что имеет большое значение для диагностики и прогнозирования тяжести некоторых заболеваний, особенно у иммунокомпрометированных пациентов.

ПОДГОТОВКА

Взятие венозной крови для получения сыворотки.

МЕТОДИКА

Исследуемую сыворотку помещают в лунки агарового геля, который содержит АТ к иммуноглобулинам одного из классов IgG, IgA или IgM в известной концентрации. Иммуноглобулины, диффундирующие из лунок в агар, при взаимодействии с соответствующими АТ образуют кольца преципитации, размер которых прямо пропорционален содержанию иммуноглобулина.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Содержание основных классов иммуноглобулинов в образцах сыворотки крови сопоставляют с нормативными показателями. Чувствительность и специфичность зависят от качества используемых реагентов.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Повторное замораживание и оттаивание исследуемых образцов.
• Бактериальное загрязнение.
• Нарушения условий хранения образцов (оптимальная температура хранения сыворотки — 4 °С, для длительного хранения используют температуру –20 °С).

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Иммуноферментный анализ, турбодиметрическое исследование.

МЕТОД ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

СИНОНИМЫ

Оценка продукции активных форм кислорода фагоцитирующими клетками крови.

ОБОСНОВАНИЕ

Центральное место в антимикробной активности фагоцитирующих клеток периферической крови занимает кислородный, или респираторный, «взрыв», вследствие чего генерируются активные формы кислорода в системе НАДФНоксидазы. В оценке кислородного «взрыва» наиболее широко используют методы измерения генерируемых во внеклеточную среду супероксидного аниона или перекиси водорода по их способности окислять соответствующий субстрат (люцигенин или люминол) в люминесцирующий метаболит.

ЦЕЛЬ

Оценка спонтанной и индуцированной продукции активных форм кислорода лейкоцитами крови.

ПОКАЗАНИЯ

Метод эффективен для оценки функционального состояния фагоцитов периферической крови (гранулоцитов и моноцитов), его используют для прогнозирования тяжести заболевания и контроля эффективности терапии при воспалительных процессах.

ПОДГОТОВКА

Кровь, взятую из вены в пробирки с гепарином (2 Ед/мл), разводят раствором Хенкса без кальция в пропорции 1:1, сохраняют в течение 1 ч при 4 °С.

МЕТОДИКА

Продукцию активных форм кислорода оценивают по люминолзависимой хемилюминесценции с помощью хемилюминометра. Разведённую кровь добавляют в ячейки для измерений, содержащие среду Хенкса с добавлением 1 мМ кальция и раствор люминола. Проводят измерение спонтанной хемилюминесценции и хемилюминесценции, активированной опсонизированным зимозаном. Результаты измерения регистрируют непрерывно в виде кинетической кривой. Интенсивность хемилюминесцентного ответа оценивают по максимальному значению на кинетической кривой.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

В результате анализа получают показатели спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, рассчитывают индекс активации (отношение индуцированной к спонтанной реакции), сопоставляют их с нормативными показателями. Чувствительность и специфичность зависят от качества используемых реагентов.

ФАКТОР, ВЛИЯЮЩИЙ НА РЕЗУЛЬТАТ

На результат влияет длительность интервала времени, прошедшего с момента взятия крови. Исследование проводят не позднее чем через 4 ч после взятия крови.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

• Применение теста восстановления нитросинего тетразолия.
• Оценка активных форм кислорода методом проточной цитометрии.

ОЦЕНКА ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА

ОБОСНОВАНИЕ

ИФН — биологически активные белки или гликопротеиды, синтезируемые клеткой в процессе защитной реакции на чужеродные Аг, представляют собой первую линию защиты против вирусов, принимают участие в стимуляции фагоцитоза, усиливают естественную цитотоксическую активность, оказывают антипролиферативное действие на нормальные и опухолевые клетки. Определение интерферонового статуса — один из тестов оценки иммунореактивности организма.

ЦЕЛЬ

Определение содержания общей фракции сывороточных ИФН, уровня спонтанной и индуцированной in vitro продукции

ИФНα и ИФНγ.

ПОКАЗАНИЯ

Метод используют для оценки функционального состояния лейкоцитов периферической крови, применяют для прогнозирования тяжести заболевания и для контроля эффективности терапии при острых и хронических вирусных инфекциях, аллергических и аутоиммунных заболеваниях, при разработке индивидуальных схем лечения препаратами ИФН и его индукторами.

ПОДГОТОВКА

Взятие венозной крови стерильным одноразовым шприцем в объёме 2 мл в стерильную пробирку с крышкой, содержащую гепарин (2 Ед/мл).

МЕТОДИКА

Тестирование проводят в стерильных 96луночных круглодонных планшетах в трёх повторах. Клетки инкубируют при 37 °С без индукторов, с вирусом болезни Ньюкасла для индукции ИФНα, с фитогемагглютинином Р для индукции ИФНγ. Оставшуюся кровь центрифугируют и используют для определения сывороточного ИФН. Титрование ИФН проводят в 96луночных плоскодонных планшетах с диплоидной культурой фибробластов человека М19. В качестве тествируса используют вирус мышиного энцефаломиокардита. За единицу активности ИФН принимают величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя клеток на 50% (Е/мл).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Повышение титров сывороточного ИФН может свидетельствовать об острой стадии заболевания. Существует прямая связь между показателями ИФНα и ИФНγ и тяжестью заболевания, а также обратная связь с количеством сывороточного ИФН. Снижение продукции ИФНα и ИФНγ указывает на дефект системы ИФН (врождённый или приобретённый); это показание для ИФНстимулирующей терапии.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Продолжительность интервала времени, прошедшего с момента взятия крови (не более 4 ч).
• Нарушение стерильности.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

• Иммуноферментный метод.
• Внутриклеточное окрашивание цитокинов в стимулированных клетках, регистрация результатов с помощью проточной цитофлюориметрии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ

СИНОНИМЫ

Определение содержания цитокинов в крови, цитокиновый статус.

ОБОСНОВАНИЕ

Цитокины — медиаторы взаимодействия иммунокомпетентных клеток, регулируют процессы их пролиферации и дифференцировки, обеспечивая нормальное функционирование иммунной системы. Цитокины синтезируются клетками иммунной системы после их активации чужеродными или собственными модифицированными Аг. Определённые провоспалительные цитокины, такие как ИЛ1β, ИЛ6, фактор некроза опухолиα, обеспечивают формирование очага воспаления, и их концентрация в сыворотке крови отражает степень воспалительного процесса. Противовоспалительные цитокины (типичный представитель — ИЛ10) блокируют активность Тлимфоцитов, моноцитов/макрофагов и синтез этими клетками провоспалительных цитокинов. Цитокины участвуют в патогенезе некоторых заболеваний, и определение цитокинового профиля может способствовать уточнению диагноза или стадии заболевания.

ЦЕЛЬ

Измерение содержания определённых цитокинов в сыворотке крови для уточнения диагноза или стадии заболевания.

ПОКАЗАНИЯ

Острые и хронические воспалительные, гиперпластические и опухолевые процессы в органах женской репродуктивной системы.

ПОДГОТОВКА

Взятие крови до приёма пищи.

МЕТОДИКА

Иммуноферментный метод определения Аг (в данном случае цитокинов) в сыворотке крови с использованием различных систем детекции.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Показатели содержания цитокинов в сыворотке крови здоровых женщин не должны превышать 50 пг/мл. Результат исследования может служить дополнительным показателем при диагностике и контроле эффективности лечения женского бесплодия, ВЗОМТ, эндометриоза. Чувствительность и специфичность метода зависят от качества используемых реагентов.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Продукты лизиса эритроцитов в исследуемой сыворотке.
• Срок хранения. Следует хранить сыворотки при 4 °С не более 6 ч, при замораживании до –40 °С — до 6 мес.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

• Тестирование биологической активности цитокинов.
• Внутриклеточное окрашивание цитокинов в стимулированных клетках и использование проточной цитофлюориметрии.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИФОСФОЛИПИДНЫХ АНТИТЕЛ К КАРДИОЛИПИНУ, ФОСФАТИДИЛСЕРИНУ, Β2ГЛИКОПРОТЕИНУ, АННЕКСИНУ, ПРОТРОМБИНУ

СИНОНИМЫ

Иммуноферментный анализ для определения антифосфолипидных АТ (IgG, IgM, IgА).

ОБОСНОВАНИЕ

АТ, направленные против фосфолипидов и фосфолипидсвязывающих белков, могут ассоциироваться с эндометриозом, бесплодием неясного генеза, неудачными попытками ЭКО и ПЭ в полость матки.

ЦЕЛЬ

Тест предназначен для количественного определения АТ к фосфолипидам и фосфолипидсвязывающим белкам в сыворотке крови.

ПОКАЗАНИЯ

Рекомендуют для включения в обследование женщин с бесплодием неясного генеза, при эндометриозе и подготовке к ЭКО, ПЭ и беременности.

ПОДГОТОВКА

Все реагенты и исследуемый материал перед использованием выдерживают при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

МЕТОДИКА

Количественный непрямой твёрдофазный иммуноферментный анализ. АТ из исследуемого материала и стандартов связываются с фосфолипидами и фосфолипидсвязывающими белками, иммобилизованными на поверхности лунок планшета. Это можно обнаружить с помощью конъюгата поликлональных АТ против иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена по изменению окрашивания субстратнохромогенного раствора. Оптическую плотность измеряют на фотометре при длине волны 450 нм, рассчитывают средние значения оптической плотности для стандартов, контролей и образцов, с помощью калибровочной кривой по значению оптической плотности определяют соответствующую концентрацию АТ в Ед/мл.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Нормальный диапазон концентраций:

• АТ к кардиолипину: 0–10 Ед/мл;
• АТ к фосфатидилсерину: 0–10 Ед/мл;
• АТ к β2гликопротеину: 0–5 Ед/мл;
• АТ к аннексину: 0–5 Ед/мл;
• АТ к протромбину: 0–10 Ед/мл.

Чувствительность и специфичность: метод специфичен для АТ к соответствующим фосфолипидам и фосфолипидсвязывающим белкам. Перекрестных реакций с АТ к ДНК или другими сифилисспецифичными АТ не отмечено. Нижняя граница определения АТ классов IgG и IgМ составляет 0,5 Ед/мл.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

• Гемолиз.
• Гиперлипидемия.
• Повторное замораживание и оттаивание исследуемых сывороток.
• Бактериальное загрязнение.
• Изменение концентрации исследуемых образцов.
• Нарушения условий хранения сывороток.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОВАРИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

СИНОНИМЫ

Иммуноферментный анализ для определения антиовариальных АТ (IgG, IgM, IgА).

ОБОСНОВАНИЕ

АТ, направленные против Аг яичников, могут вызывать бесплодие у женщин.

ЦЕЛЬ

Тест предназначен для определения АТ, направленных против тканей яичника человека, в сыворотке крови, в цервикальной слизи, маточном секрете и фолликулярной жидкости.

ПОКАЗАНИЯ

Метод рекомендован для включения в план обследования женщин с бесплодием неясного генеза, с первичной яичниковой недостаточностью.

ПОДГОТОВКА

Все реагенты и исследуемый материал перед использованием выдерживают при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

МЕТОДИКА

Тест представляет собой количественный твёрдофазный иммуноферментный анализ (принцип метода аналогичен иммуноферментному анализу для определения антифосфолипидных АТ).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Нормальный диапазон концентраций: 0–10 Ед/мл.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

Гемолиз.

• Повторное замораживание и оттаивание исследуемых образцов.
• Нарушение требований к процедуре взятия цервикальной слизи, маточной и фолликулярной жидкости.
• Нарушение условий хранения образцов.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

СИНОНИМЫ

Тесты для обнаружения АТ к Аг ЦМВ, ВИЧ, ВПГ; хламидий или микоплазм.

ОБОСНОВАНИЕ

Большинство урогенитальных инфекций имеют хроническое течение, поэтому диагностическое значение имеет не только факт обнаружения АТ против данного возбудителя, но и величина их титра, а также класс (IgM, IgА или IgG).

ЦЕЛЬ

Тесты предназначены для количественного определения АТ к Аг ЦМВ, ВИЧ, ВПГ; хламидий или микоплазм.

ПОКАЗАНИЯ

Метод рекомендован для включения в план обследования пациентов с симптомами воспалительных урогенитальных заболеваний, при подготовке женщин к беременности.

ПОДГОТОВКА

Взятие крови из вены и получение сыворотки.

МЕТОДИКА

Тест представляет собой количественный твёрдофазный иммуноферментный анализ.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Обнаружение IgGАТ служит показателем ранее перенесённого заболевания. По существенному изменению титра АТ при повторном исследовании (с 7–14дневным интервалом) можно судить о стадии заболевания. Обнаружение IgMАТ свидетельствует о недавнем инфицировании или об активном процессе, повышение их содержания происходит при реактивации или реинфицировании. IgА обнаруживают при остром или подостром процессе. Чувствительность составляет 97–98%, специфичность варьирует от 80 до 95%.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Радиоиммунный метод.

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ 2 И 9 (ММП2 И ММП9) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (ЗИМОГРАФИЯ)

СИНОНИМЫ

Метод вертикального субстратного электрофореза.

ОБОСНОВАНИЕ

Экспрессия ММП2 и ММП9 в тканях отражает происходящие в них процессы тканевого ремоделирования как в норме (менструация, овуляция, имплантация), так и при патологии (воспалительные и гиперпластические процессы, фиброзы). Тканевые ММП2 и ММП9 проникают в кровь в концентрациях, пропорциональных их экспрессии в тканях. Измерение их концентрации в сыворотке крови даёт информацию о состоянии тканевой реконструкции и позволяет оценить динамику проявлений патологического процесса и эффективности лечения.

ЦЕЛЬ

Диагностика воспалительных и гиперпластических процессов в органах женской репродуктивной системы и мониторинг течения и эффективности лечения.

ПОКАЗАНИЯ

Воспалительные и гиперпластические процессы в органах женской репродуктивной системы, в частности хронический эндометрит, гиперпластические процессы в эндометрии, эндометриоз.

ПОДГОТОВКА

Из венозной крови пациента отделяют сыворотку и подвергают её исследованию или хранят при температуре –20 °С до последующего исследования.

МЕТОДИКА

Образцы сывороток наносят на полиакриламидный гель, содержащий субстрат для ММП2 и ММП9, белки сыворотки разделяют под действием электрического тока. Далее гель инкубируют, при этом находящиеся в нем ММГ2 и ММГ9 протеолитически разрушают субстрат. После специфического окрашивания обнаруживают полосы геля, не содержащие субстрат. Эти полосы соответствуют находящимся в этих участках ММП2 и ММП9. Интенсивность окрашивания полос пропорциональна содержанию ММП2 и ММП9.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Результаты интерпретируют полуколичественно в сравнении с образцами от здоровых субъектов, в баллах или процентах от интенсивности окраски контрольных полос. Чувствительность, по данным разных исследований, колеблется от 80 до 95,3%, специфичность — от 52 до 75%.

Гуморальное звено иммунитета характеризуют уровни CD3^–CD19⁺, CD3-CD20⁺, CD3-CD21⁺ и CD3^–CD22⁺-клеток (В-лимфоцитов в разные фазы созревания), а также уровни иммуноглобулинов разных классов (IgМ, IgG, IgE, сывороточного и секреторного IgA). Поскольку синтез антител является Т-зависимым процессом, для надлежащей оценки гуморального звена иммунитета следует учитывать уровень
Т-хелперов (CD3⁺СD4⁺ Т-лимфоцитов), что еще раз подтверждает целесообразность комплексного подхода к интерпретации иммунограммы. Гуморальное звено является преобладающим при бактериальных инфекциях с внеклеточным пребыванием патогена (стрептококки, стафилококки, эшерихии, синегнойная палочка, протей и др.), а также при полостных протозойных и гельминтных инвазиях.

IgМ – это антитела острого периода иммунного ответа, которые синтезируются плазматическими клетками при первом контакте с определенным патогеном. IgМ имеет сразу 10 центров связывания антигенов, что особенно актуально именно в острый период инфекции, когда существует необходимость в быстром распознавании и уничтожении большого количества патогена. Этому требованию отвечает и наиболее сильная среди всех иммуноглобулинов способность IgМ активировать комплемент, что обеспечивает реализацию комплемент-зависимой цитотоксичности. В среднем, высокие концентрации специфических IgМ регистрируются с 6-7 дня после инфицирования, позднее уровень IgМ заметно снижается на фоне повышения содержания IgG, то есть происходит переключение c синтеза IgM на IgG. Существует наследственная форма ИДЗ, связанная с нарушением переключения изотипов антител. У таких больных регистрируются очень высокие уровни IgМ на фоне глубокого дефицита антител других классов. В клинике это проявляется склонностью к развитию хронических инфекций.
Диагностическое значение высоких уровней специфических IgМ состоит в возможности установления факта острой инфекции, при которой имело место первичное инфицирование определенным возбудителем. Однако следует учитывать, что у больных ИДЗ нарушается формирование иммунной памяти, в связи с чем возможны случаи, когда при повторном инфицировании тем же возбудителем вновь имеет место фаза преобладающей продукции IgМ. Указанная особенность может быть лабораторным критерием постановки диагноза ИДЗ.

IgG – это антитела поздней фазы иммунного ответа, которые начинают синтезироваться после периода преобладания IgМ. В свойствах IgG учтены условия периодов регресса клинических проявлений и реконвалесценции воспалительного процесса, на протяжении которых количество патогена уменьшается и первоочередным для излечения является качество распознавания антигена. В связи с этим, IgG является более специфическим антителом, чем IgМ. С другой стороны, в свойствах IgG учтены недостатки молекулы IgМ, которые, в связи с большими размерами, имеют довольно ограниченную способность проникать в ткани. Для успешной эрадикации патогена необходимо обеспечение надежного контроля периферических тканей со стороны иммуноглобулинов на предмет наличия патогена. IgG, которые имеют лишь 2 центра связывания антигена и меньшую молекулярную массу, имеют лучшую способность проникать в периферические ткани.
Высокие уровни специфических IgG регистрируются в периоды регресса клинических проявлений и реконвалесценции при остром воспалительном процессе. Специфические IgG могут продуцироваться и циркулировать в сыворотке крови на протяжении продолжительного срока после излечения, поскольку именно этот класс антител синтезируется клетками иммунной памяти. Выбор IgG для обеспечения иммунной памяти является не случайным, так как это одновременно и наиболее экономные, и наиболее специфические антитела. После перенесенной инфекции может обеспечиваться или стабильная концентрация специфических IgG, или иметь место постепенное снижение их титров. Возрастание титров специфических IgG через продолжительный срок после перенесенного острого воспалительного процесса свидетельствует не о поддержании иммунной памяти, а о неполном излечении и хронизации инфекции, так как IgG являются антителами вторичного иммунного ответа, который реализуется при контакте с уже знакомым антигеном. Таким образом, при повторной острой инфекции или обострении хронической инфекции фаза преобладания IgМ отсутствует, так как сразу же синтезируются IgG. Нарушение такой закономерности может быть критерием ИДЗ. Дефицит IgG наиболее часто проявляется в виде хронических гнойных бронхитов, синуитов и отитов, пневмоний, которые являются резистентными к лечению антибиотиками, а также в виде гнойничковых заболеваний кожи (пустулёз, фурункулез, карбункулы, абсцессы и т.п.) с хроническим или рецидивирующим течением.
Известно, что популяция IgG является неоднородной. Клинические проявления дефектов отдельных субпопуляций IgG приведены в

 IgА – это иммуноглобулины слизистых оболочек и кожи. Различают сывороточную и секреторную формы IgА. Дефицит sIgА может быть связан как со снижением концентрации сывороточной формы, которая является предшественницей секреторной, так и с нарушением деятельности эпителия, где для IgА синтезируется секреторный компонент, защищающий молекулу иммуноглобулина от расщепления пищеварительными ферментами. Таким образом, для адекватной оценки обмена IgА необходимо проводить параллельное исследование уровней его сывороточных и секреторных форм.
sIgА играет важную роль в поддержании иммунной памяти слизистых и обеспечении феномена иммунной солидарности слизистых оболочек. При дефиците sIgА в клинике отмечается высокая восприимчивость к инфекциям (особенно вирусной природы), входные ворота которых формируются на слизистых оболочках. Часто дефицит указанного иммуноглобулина является причиной хронического вирусного лимфаденита и тимомегалии. Кроме того, дефицит sIgА может лежать в основе сочетанных воспалительных процессов на слизистых различных органов (например, хронического гайморита и гастродуоденита), что является результатом нарушения поддержания иммунной солидарности слизистых.

IgЕ являются антителами второго уровня защиты слизистых оболочек. Если патоген преодолевает защитный барьер sIgА, он распознается IgЕ, которые продуцируются в миндалинах, лимфоузлах, солитарных лимфатических фолликулах, что приводит к дегрануляции тучных клеток и развитию воспаления слизистой оболочки. Другими словами, механизм, связанный с деятельностью IgЕ, является альтернативой нейтрализующему эффекту sIgА. Кроме того, IgЕ играют ключевую роль в антипротозойном и противогельминтном иммунитете. Плохую репутацию у клиницистов IgЕ получили благодаря участию в атопических реакциях.

  IgD – иммуноглобулины с неустановленной функцией.

Нормативные величины сывороточных уровней антител разных классов приведены в табл. 29.

Оценка эффекторного звена иммунного ответа. Эффекторным называется конечное повреждающее звено иммунного ответа. Эффекторные звенья клеточного и гуморального ответа различаются между собой. Для оценки эффекторного звена клеточного иммунитета определяют содержание больших гранулярных лимфоцитов – популяции клеток, в состав которой входят естественные киллеры и цитотоксические Т-лимфоциты. Содержание БГЛ характеризует количественную сторону эффекторного звена иммунного ответа по клеточному типу. Более полную информацию можно получить при параллельном определении цитотоксичности мононуклеаров, что является качественным показателем. Под мононуклеарами понимают макрофаги, естественные киллеры и цитотоксические Т-лимфоциты. Эффекторным звеном гуморального иммунного ответа является синтез антител (речь идет о нейтрализующих антителах) и фагоцитоз, за счет которого обезвреживаются сформированные иммунные комплексы.

 Короткая характеристика основных субпопуляций лимфоцитов по CD-маркерам

 CD3⁺ лимфоциты. Практически все зрелые Т-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности CD3 маркерные молекулы, поэтому уровень CD3⁺ клеток является интегральным (обобщающим) показателем Т-клеточного звена иммунитета.
CD4⁺ лимфоциты. Молекулы CD4 экспрессируют на своей поверхности Т-лимфоциты, которые получили название хелперов. Это главные регуляторные клетки иммунного ответа. От деятельности Т-хелперов зависит как направление разворачивания иммунного ответа, так и его эффективность. CD4 выполняет роль корецептора, стабилизируя рецепторы антиген-презентирующей клетки и Т-хелпера во время антигенной презентации.
CD8⁺ лимфоциты. Молекулы CD8 содержат на своей поверхности цитотоксические Т-лимфоциты. Это эффекторные клетки иммунного ответа. Именно цитотоксические Т-лимфоциты наносят конечный повреждающий удар по мишеням иммунной агрессии (опухолевым и инфицированным клеткам). CD8 молекула выступает в роли корецептора, стабилизируя взаимодействие рецепторов Т-киллера и клетки-мишени во время иммунного распознавания последней.
CD16⁺ лимфоциты. Это так называемые естественные киллеры, также совершающие цитотоксическое влияние на инфицированные и опухолевые клетки, однако, в отличие от Т-киллеров, не осуществляющие специфического иммунного распознавания антигенов мишени. Естественные киллеры распознают скомпрометированные клетки по упрощенной схеме, ключевым моментом в которой является прекращение экспрессии молекул HLA I клеткой-мишенью, что есть защитным механизмом от Т-киллеров. Естественные киллеры самостоятельно работают на ранних этапах вирусной инфекции, на поздних же к противоинфекционной защите приобщаются цитотоксические Т-лимфоциты, исправляющие «ошибки» первых. Дефицит ЕК является фактором риска возникновения частых ОРВИ и опасности формирования опухолей.
CD22⁺ лимфоциты. Маркеры CD22 экспрессируют зрелые В-лимфоциты. Этот показатель характеризует гуморальное звено иммунитета. Собственно В-лимфоциты не секретируют антител. Непосредственной продукцией иммуноглобулинов занимаются плазматические клетки, являющиеся производными В-лимфоцитов. Дефекты гуморального иммунитета, связанные собственно с В-клетками, встречаются очень редко, поэтому довольно распространенная гипоиммуноглобулинемия, в основном, обусловлена другими причинами.

Функциональные показатели иммунограммы. Все показатели иммунограммы можно разделить на качественные и количественные. До сих пор речь шла преимущественно о количественных показателях. К качественным показателям принадлежат реакции бласттрансформации Т- и В-лимфоцитов (РБТЛ). Данные указанных исследований позволяют оценить пролиферативный потенциал иммунокомпетентных клеток и обнаружить дефекты иммунитета, связанные с недостаточно интенсивным размножением лимфоцитов. Для индукции РБТЛ используют специальные вещества, вызывающие митоз лимфоцитов. Такие вещества получили название митогенов. Митогены Т- и В-лимфоцитов различаются между собой. Так, в качестве митогенов для Т-лимфоцитов выступают фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон-А), а для В-клеток – липополисахариды бактерий. На практике изучают спонтанную пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток и индуцированную митогенами. За счет оценки полученной разницы делают косвенный вывод о пролиферативной мобильности лимфоцитов – оперативности вовлечения в процессы деления в случае иммунной реакции.
Также для оценки функциональной способности лимфоцитов определяют количество клеток, экспрессирующих адгезионные молекулы (в частности, ІСАМ-1 или СD54). Кроме того, возможно измерение уровней лимфоцитов по методике розеткообразования (Е-РОЛ), по которым определяются преимущественно активированные, вовлеченные в иммунный ответ клетки. Функциональную характеристику предоставляют также исследования уровней тех или иных цитокинов (медиаторов иммунного ответа) в плазме крови.
Комплекс показателей содержания разных цитокинов больного составляет егоцитокиновый профиль. Уровни ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-8, ГМ-КСФ характеризуют функциональную активность клеток врожденной резистентности, содержание ИЛ-2, ИФН-γ, ФНО-α, ФНО-β свидетельствует о функциональной активности Т-хелперов 1 типа, а содержание цитокинов ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13 – о деятельности Т-хелперов 2 типа. Цитокины ИЛ-10 и ТФР-β имеют антивоспалительные свойства, их преимущественная продукция наблюдается в завершающую фазу иммунного ответа регуляторными Т-клетками.
При интерпретации данных цитокинового профиля необходимо придерживаться таких принципов. Во-первых, следует оценивать не каждый показатель в отдельности, а указанные выше группы показателей. Это связано с тем, что источником синтеза одного и того же цитокина могут быть принципиально разные клетки. Например, ФНО-α является продуктом как активированных макрофагов, так и Т-хелперов 1 типа. Поэтому при изолированной оценке данного показателя нельзя однозначно утверждать об активации какого-то одного звена иммунитета. Однако если повышение содержания ФНО-α происходит на фоне высокого уровня ИЛ-1β и ИЛ-8 и относительно низкого – ИЛ-2, можно говорить о преобладающем вовлечении факторов врожденной резистентности. С другой стороны, в случае значительного уровня ФНО-α при высоком содержании ИЛ-2 и ИФН-γ и падающем ИЛ-1β есть основания говорить о реализации лимфоцитарной фазы иммунного ответа.
Во-вторых, целесообразно проводить оценку полученных результатов в контексте ожидаемой фазы острого воспалительного ответа. Так, в первые дни острого воспалительного процесса или обострения хронического благоприятным признаком является резкое повышение содержания доиммунных цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-8, ГМ-КСФ), однако продолжительное сохранение высоких уровней указанных показателей свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания, поскольку указывает на трудности в переключении на специфическую (адаптивную) фазу иммунного ответа, опосредствованную регуляторной активностью Т-хелперов. Преждевременная гиперпродукция антивоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ТФР-β) в разгар воспалительного процесса может содействовать неполному уничтожению патогена и хронизации инфекции.
В-третьих, при интерпретации результатов показателей цитокинового профиля следует учитывать этиологический фактор, определенный по клиническим признакам, результатами ПЦР, микробиологическими методами. При этом можно установить ожидаемый тип иммунограммы (нейтрофильно-лимфоцитарный, лимфоцитарный и нейтрофильный). Так, относительно продолжительное сохранение высоких уровней доиммунных цитокинов является допустимым при бактериальном генезе инфекции (нейтрофильно-лимфоцитарный тип иммунограммы), но является неблагоприятным признаком при вирусной природе болезни, при которой нейтрофильная фаза короткая.
Указанных принципов (комплексность подхода, учет стадии иммунного ответа и этиологии) следует придерживаться и при интерпретации других показателей иммунограммы. Так, при выяснении причины гипоиммуноглобулинемии следует оценивать не только содержание и активность В-лимфоцитов (продуцентов антител), но и уровень Т-лимфоцитов, которые отбирают надлежащие клоны В-лимфоцитов и предоставляют им ко-стимулирующий сигнал, а также активность фагоцитоза, на основании которого осуществляется антигенная презентации (то есть отбираются антигенспецифические клоны Т-хелперов). Таким образом, недостаточная продукция антител может быть следствием как сниженного фагоцитоза, так и Т- или
В-клеточной недостаточности, которая требует комплексного подхода к поиску причины гипоиммуноглобулинемии.
Важна и оценка стадии иммунного ответа. Так, в случае вирусной инфекции, на ранних этапах характерным является повышение содержания естественных киллеров (CD16⁺ лимфоцитов), а в дальнейшем нарастает уровень Т-лимфоцитов (Т-хелперов 1 типа) и цитотоксических Т-клеток (СD8⁺ лимфоцитов). Если же продолжительно сохраняется высокий уровень ЕК, а содержание Т-киллеров не нарастает, это является крайне неблагоприятным признаком, свидетельствующим о риске хронизации инфекции, неполного уничтожения вирусного агента.
Важна и оценка этиологии воспалительного процесса. Так, если по клиническим признакам или данным ПЦР у больного имеет место вирусная инфекция, а показатели иммунограммы отвечают преимущественно гуморальному пути реализации иммунного ответа (усиление фагоцитоза, продолжительная нейтрофильная фаза, резкое увеличение уровней В-лимфоцитов и антител при относительно низких значениях ЕК, СD4⁺ и CD8⁺ клеток), то это может быть показанием для проведения иммунокорригирующей терапии.

Иммунорегуляторный индекс. Довольно часто в состав иммунограммы включают так называемый иммунорегуляторный индекс, который является соотношением уровней CD3⁺CD4⁺ к CD8⁺ Т-лимфоцитам. Ранее считали, что в состав субпопуляции CD3⁺CD8⁺ Т-лимфоцитов входят так называемые клетки-супрессоры, угнетающие иммунный ответ. Сегодня установлено, что отдельной субпопуляции супрессоров не существует, а CD3⁺СD8⁺ Т-лимфоциты наделены цитотоксическими свойствами (клетки-киллеры). В связи с этим, изменилось понимание клинического значения оценки величины иммунорегуляторного индекса.
Сегодня уровень иммунорегуляторного индекса оценивают в сопоставлении с фазой иммунного ответа. В период разгара и стихания клинических проявлений иммунорегуляторный индекс достигает высоких значений за счет большого процентного содержания Т-хелперов (CD4⁺ Т-клеток). В период реконвалесценции значение показателя уменьшается, в связи с нарастанием уровня CD8⁺ Т-клеток (киллеров). Нарушение такой закономерности свидетельствует о неадекватности иммунной реакции и о возможности хронизации инфекции, в связи с неполной эрадикацией возбудителя.

Индекс нагрузки. Этот показатель является соотношением уровней Е-РОЛ к Е-РОН, где Е-РОЛ – это розеткообразующие Т-лимфоциты, выявленные в тесте розеткообразования с эритроцитами барана, а Е-РОН – розеткообразующие нейтрофилы, выявленные в том же тесте. По утверждению автора (Лебедев К.А.), индекс нагрузки имеет наиболее сильную отрицательную корреляционную связь с уровнем связанности компонентов иммунной системы и разрешает судить о напряженности воспалительного процесса. Динамика уровня индекса нагрузки приведена в параграфе, посвященном клинико-иммунологической характеристике стадий острого воспалительного процесса.

Оценка апоптоза. Одним из механизмов формирования иммунного дефекта является патологический апоптоз иммунокомпетентных клеток. Для выявления повышенной готовности лимфоцитов к апоптозу (состояния, предшествующего запрограммированной гибели) проводят определение уровня клеток, экспрессирующих рецепторы к апоптозу (в частности, рецептор Fas или CD95). Фазу непосредственной реализации патологического апоптоза определяют по снижению уровня лимфоцитов на фоне клинически незавершенного патологического процесса или по уменьшению уровня зрелых Т-лимфоцитов (СD3⁺, СD3⁺СD4⁺, СD3⁺CD8⁺ Т-клеток) на фоне повышения уровня нулевых лимфоцитов (в этом случае лимфопении может и не быть). Параллельно фиксируется снижение уровня провоспалительных лимфоцитарных цитокинов и повышение содержания антивоспалительных факторов, в частности ИЛ-10, что носит компенсаторный характер. Исследование апоптоза является очень важным, поскольку неадекватная запрограммированная гибель иммуноцитов является одним из механизмов формирования ИДЗ.

 Оценка склонности к аутоиммунным реакциям. Отдельную группу в иммунограмме составляют показатели, которые характеризуют аутоиммунную настроенность иммунного ответа. В условиях иммунных дефектов нарушается реализация всех функций иммунной системы, в том числе способности к поддержанию иммунной толерантности. Следствием этого является усиление аутоиммунного компонента иммунного ответа у больных ИДЗ. Об указанной тенденции может свидетельствовать повышение содержания циркулирующих иммунных комплексов, возрастание уровня аутоантител (например, РФ, против основного белка миелина, антинуклеарных и т.п.), усиление аутосенсибилизации нейтрофилов и некоторые другие показатели.

  Компенсация иммунного дефекта. Для правильной оценки иммунограммы следует понимать, что при дефекте определенных иммунных факторов может повышаться содержание других факторов иммунитета, выполняющих смежные функции. Это является компенсаторным механизмом. Наличие компенсаторных механизмов является прогностически благоприятным фактором, который свидетельствует о достаточно высоком ожидаемом эффекте адекватной иммунотропной терапии. Наоборот, отсутствие компенсаторных механизмов в условиях наличия иммунных дефектов свидетельствует в пользу запущенного процесса и является неблагоприятным прогностическим фактором. Неблагоприятный прогноз связан с исчерпанием компенсаторных резервов иммунной системы. Напомним, что ведущим механизмом формирования ИДЗ из вторичной иммунной недостаточности есть исчерпание компенсаторных механизмов при продолжительном существовании иммунного дефекта. Это свидетельствует о необходимости как можно более раннего выявления больных с дисфункциями иммунной системы.
Можно привести много примеров компенсаторных изменений иммунологических показателей. Так, одним из компенсаторных механизмов является повышение уровня естественных киллеров (иногда в 2-3 раза и выше) при дефиците Т-клеток (в частности, CD8⁺ лимфоцитов). Естественные киллеры, выполняющие смежные функции с цитотоксическими Т-лимфоцитами, могут частично компенсировать недостаток функции последних (особенно эффективно – при надлежащем антителогенезе). Однако, чаще всего, такая компенсация является неполной и обеспечивает лишь сдерживание вируса, но не его эрадикацию. Другим примером компенсаторной реакции может быть существенное повышение показателя фагоцитоза у больных с дефицитом миелопероксидазы фагоцитирующих клеток. При этом недостаточно эффективная продукция свободных радикалов, в формировании которых принимает участие указанный фермент, частично компенсируется усиленной поглотительной активностью нейтрофилов, что обеспечивает временную изоляцию инфекционного агента.

Синдром диссоциации. При интерпретации результатов иммунограммы можно обнаружить синдром диссоциации – несоответствие между направлением изменений взаимосвязанных иммунологических показателей. Ценность синдрома диссоциации состоит в том, что последний может свидетельствовать в пользу скрытых иммунных дефектов (например, существующий лишь на функциональном уровне). Синдром диссоциации – типичная находка у больного ИДЗ. Диссоциация определяется не только между отдельными иммунологическими показателями, но и между данными общего анализа крови и иммунограммы, между результатами иммунограммы и клинической картиной болезни.
Типичным примером диссоциации является факт повышения уровня специфических противовирусных антител на фоне возрастающих показателей количественной ПЦР, которая, как известно, определяет содержание вирусной нуклеиновой кислоты. Теоретически повышение уровня специфических антител должно было бы привести к снижению репликации вируса. Однако в условиях, например, нарушенного фагоцитоза не происходит надлежащей антигенной презентации, что может приводить к формированию недостаточно специфических антител к данному штамму вируса. При этом серологические исследования могут указывать на достаточную специфичность сформированных антител, однако следует учитывать, что такие исследования ориентированы лишь на определенные типичные антигены и не учитывают особенностей антигенного спектра конкретного штамма вируса.
Диссоциацией также является отсутствие клинического регресса симптомов воспаления при переходе в лимфоцитарную фазу иммунного ответа на бактериальные патогены. Причина такой диссоциации может быть связана со снижением функциональной активности лимфоцитов, дефектами продукции антител, синтезом недостаточно специфических антител вследствие снижения фагоцитоза. Еще одним примером диссоциации является наличие документально подтвержденной вирусной инфекции на фоне признаков преимущественного гуморального направления разворачивания иммунного ответа по данным иммунограммы. Можно привести еще немало примеров диссоциации между клиническими, иммунологическими данными и результатами общего анализа крови. Важно подчеркнуть, что синдром диссоциации является признаком ИДЗ и лучше обнаруживается при динамическом проведении исследований и комплексной оценке их результатов.